مقايسة تنقية التقارب الترادفي لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين

تنقية التقارب الترادفي هو مخطط تنقية متسلسل لعزل مجمعات البروتين عن الخلايا لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين.

للبدء ، خذ ثقافة خلية تعبر عن البروتينات ذات العلامات الهاتمة ذات الأهمية. تشكل البروتينات مركبا داخل الخلية. يحتوي أحد البروتينات الموجودة في المجمع على علامة Strep ، بينما يتم تصنيف الآخر بعلامة FLAG. هذه هي علامات التقارب الصغيرة القائمة على تسلسل الببتيد الاصطناعي.

قم بإزالة الوسط وأضف محلول منظف لتحلل الخلايا. جهاز طرد مركزي لإزالة الحطام الخلوي. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على مركب البروتين المستهدف والبروتينات الخلوية الأخرى.

أضف حبات البكتيريا العقدية - حبات الاغاروز المغلفة بالستربتافيدين - واحتضنها. ترتبط علامة البكتيريا العقدية لمركب البروتين بالستربتافيدين. جهاز طرد مركزي لجمع الخرز المركب للبروتين. يغسل لإزالة أي بروتينات خلوية ملوثة.

أضف المخزن المؤقت للشطف الذي يحتوي على ديسثيوبيوتين - مشتق من البيوتين - والذي يحل محل مركب البروتين عن طريق الارتباط التنافسي بالستربتافيدين. جهاز طرد مركزي للحصول على مادة طافية تحتوي على مركب البروتين المملوء.

أضف حبات FLAG - حبات الاغاروز المغلفة بالأجسام المضادة ل FLAG - واحتضنها. ترتبط علامة FLAG لمركب البروتين بالجسم المضاد. جهاز طرد مركزي لجمع الخرز المركب للبروتين.

أضف المخزن المؤقت للشطف الذي يحتوي على ببتيد FLAG المجاني. يرتبط الببتيد بشكل تنافسي بالجسم المضاد ويزيح مركب البروتين المرتبط. جهاز طرد مركزي لتصفية مركب البروتين المنقى.

قم بتقييم وجود كلا البروتينين في السطح لتأكيد التفاعل بين البروتينات ذات الأهمية.

بعد تحضين مخاليط الملاط المحللة الخلوية ومخاليط الملاط STREP-Bead لمدة ساعتين ، قم بتدويرها عند 1,1500 مرة جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. احفظ المادة الطافية ك "STREP AP flow-through" ، وقم بتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية.

أضف 500 ميكرولتر من STREP AP Wash Buffer 1 إلى الخرز. قم بتقطيع الخرز والخليط العازل لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وجهاز الطرد المركزي عند 1,500 مرة جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، واغسلها مرة أخرى ب 500 ميكرولتر من STREP AP Wash Buffer 1.

بعد الغسيل الثالث ، انقل محلول الخرزة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل لتقليل خلفية البروتين. اغسل للمرة الرابعة باستخدام STREP AP Wash Buffer 1. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 500 ميكرولتر من Wash Buffer 2.

قم بموازنة الخرزات عن طريق قلب الأنابيب ، ثم قم بالدوران عند 1,500 مرة جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية. قم بإزالة البروتين محل الاهتمام ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف STREP. دوامة عند 800 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بتدوير الخرزات عند 1500 مرة جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية. يتوافق هذا الكسر مع عينة "شطف STREP AP".

احتفظ بكسر الخرزات عند 4 درجات مئوية لشطف ثان. Aliquot 10٪ من شطف STREP AP لتلوين الفضة و / أو النشاف الغربي.

لزيادة كمية المواد الأولية لترسيب المناعة اللاحق ل FLAG ، يمكن تجميع مخروطات STREP الأولى والثانية معا من أجل استرداد أكثر كفاءة لشطف FLAG.

ابدأ هذا الإجراء باستخدام طرف ماصة واسع الفوهة لنقل الكمية المناسبة من محلول حبة FLAG إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. تدور عند 1,500 مرة جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 500 ميكرولتر من FLAG Wash Buffer إلى الخرز.

تدور عند 1,500 مرة جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسلها مرة أخرى باستخدام المخزن المؤقت للغسيل FLAG. بعد الغسيل الثالث ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخرزات في مخزن غسيل FLAG إلى حجم نهائي من n في 16 ميكرولتر حيث n هو عدد العينات.

أضف 16 ميكرولترا من ملاط حبة FLAG إلى شطف STREP AP المتبقي ، واتركه طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة الليلية لملاط حبة FLAG وشطف STREP AP ، تابع الترسيب المناعي FLAG.

قم بتدوير تعليق حبات FLAG عند 1,500 مرة جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. احفظ المادة الطافية باعتباره "تدفق FLAG IP" ، وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية.

أضف 500 ميكرولتر من مخزن غسيل FLAG إلى الخرز. يسكب لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وجهاز الطرد المركزي عند 1,500 مرة جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، واغسلها مرة أخرى باستخدام 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل FLAG.

بعد الغسيل الثالث ، انقل محلول حبة البروتين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر لتقليل الخلفية. اغسل للمرة الرابعة باستخدام المخزن المؤقت للغسيل FLAG. قم بإزالة المادة الطافية من الدوران النهائي ، وأضف إلى الخرزات 30 ميكرولترا من مخزن غسيل FLAG يحتوي على 200 نانوجرام لكل ميكرولتر من ببتيد FLAG. دوامة عند 800 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.

بعد ساعتين ، قم بتدوير التعليق عند 1,500 مرة جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. احصد المادة الطافية ، وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية ك "شطف FLAG IP".