استخدام شاشة العاثية لتحديد البروتينات ذات التقارب العالي مع البروتين المستهدف

ابدأ عرض العاثيات عن طريق إضافة مكتبة العاثيات إلى آبار صفيحة متعددة الآبار ، مغلفة بالبروتين المستهدف. تحتوي مكتبة العاثيات على العاثيات المعدلة وراثيا ، يعرض كل منها متغيرا فرديا للبروتين مدمجا في بروتين معطف على سطحه. احتضان ، مما يسمح للعاثية والبروتينات المستهدفة بالتفاعل.

ترتبط العاثيات ذات البروتينات ذات التقارب البروتيني المستهدف العالي بالبروتين المستهدف. يغسل بمخزن مؤقت ، ويزيل العاثيات غير المقيدة. أضف محلولا حمضيا ، مما يؤدي إلى تعطيل العاثية واستهداف تفاعلات البروتين ، وإطلاق العاثيات في المحلول. قم بتحييد درجة الحموضة في المحلول باستخدام مخزن مؤقت ، مع الحفاظ على استقرار العاثية.

انقل العاثيات إلى أنبوب جديد. احتضان بمحلول مانع يحتوي على البروتينات ، مما يمنع التفاعلات غير المحددة.

انقل العاثيات إلى معلق بكتريا قولونية ينقسم بنشاط ، ويصيب البكتيريا ويبدأ دورة تكرار العاثيات. استكمل مع العاثيات المساعدة ، التي تصيب البكتيريا ، مما يوفر بروتينات المعطف اللازمة لتعبئة العاثيات النسلية. انقل المعلق إلى وسط انتقائي ، مما يسمح بنمو البكتيريا المصابة بالعاثيات.

يتم إطلاق العاثيات في النهاية في الوسط. الطرد المركزي. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على العاثيات. أضف محلول هطول الأمطار ، مع تركيز جزيئات العاثيات. الطرد المركزي. أعد تعليق حبيبات العاثية في مخزن مؤقت ، والحصول على تعليق متجانس.

قم بإجراء جولات اختيار العاثيات اللاحقة ؛ كرر ربط البروتين المستهدف بالعاثية ، والشطف مع زيادة خطوة صرامة الغسيل العازل ، وخطوات التضخيم والطرد المركزي ، مما يؤدي إلى إثراء أحواض العاثيات التي تعرض البروتينات ذات التقارب العالي مع البروتين المستهدف.

قم بإذابة مكتبة العاثيات على الجليد. بعد ذلك ، قم بتخفيفه إلى 100 ضعف تنوع المكتبة في PBS. أضف محلول البولي إيثيلين جلايكول / كلوريد الصوديوم في 1/5 من حجم المكتبة المخفف ، واحتضن المحلول على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحلول عند 11,000 مرة جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وقم بطردها لمدة دقيقتين أخريين لسحب المادة الطافية المتبقية وتركيز حبيبات العاثية.

أعد تعليق حبيبات العاثية برفق في مليلتر واحد من المخزن المؤقت PBT لكل بروتين مستهدف ليتم تحليله ، عادة ، أربعة في المجموع. أضف 100 ميكرولتر من مكتبة العاثيات إلى كل بئر مغلف في لوحة التحكم. احتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.

تخلص من المخزن المؤقت PB من اللوحة المستهدفة في الحوض ، وجفف اللوحة على مناشف ورقية. انقل كل 100 ميكرولتر من مكتبة العاثيات في لوحة التحكم إلى كل بئر مغلف من اللوحة المستهدفة. احتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بإزالة مكتبة العاثيات من اللوحة ، واغسل الآبار المطلية أربع مرات باستخدام عازلة PT. اقلب اللوحة واضغط على منشفة ورقية لإزالة آخر قطرات من العازلة. أضف 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 0.1 مولار إلى كل بئر مغلف لتصفية العاثية. احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بتحييد الرقم الهيدروجيني عن طريق إضافة 12.5 ميكرولتر من الرقم الهيدروجيني 11 مولي واحد من هيدروكلوريد تريس إلى كل بئر مغلف. انقل العاثية المملوءة من جميع الآبار الثمانية إلى أنبوب واحد من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر. الماصة لأعلى ولأسفل أثناء النقل لجعل المحاليل متجانسة ، وشفط كل السوائل من الآبار. أضف 10٪ BSA إلى العاثية المملوءة لجعل التركيز النهائي 1٪.

قم بتخزين أنبوب الطرد المركزي الدقيق عند أربع درجات مئوية. هذا هو إخراج الجولة الأولى. قم بإعداد مزرعة البذور لزراعة مدخلات العاثيات للجولة التالية من الاختيار عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من زراعة بذور 2YT / Tetracycline باستخدام مستعمرة بكتريا قولونية معزولة من صفيحة أجار.

احتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة. قم بتخفيف البروتين المستهدف في الجولتين الثانية والثالثة من الأنبوب بكمية مناسبة من PBS. خذ نصف محتويات الجولتين الثانية والثالثة وقم بتغطية أربعة آبار لكل بروتين مستهدف في صفيحة ربط 96 بئرا للجولة التالية.

بعد ذلك ، استخدم نصف الإخراج الدائري لتلقيح ثلاثة ملليلتر من خلايا الطور اللوغاريتمي المتوسط. احتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة. أضف M13KO7 Helper Phage إلى التركيز النهائي البالغ 10 مليارات pfu لكل ملليلتر. احتضنها مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.

بعد ساعة ، انقل ثلاثة ملليلتر من المزرعة بالكامل إلى 30 مل من محلول 2YT / Carbenicillin / Kanamycin. تنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.