الفحص المجهري للتوطين المنشط ضوئي ثنائي الجزيئات المضان المقترن

في شكله النشط ، يقوم مونومر Ras المرتبط بغشاء البلازما - وهو بروتين مرتبط بالنوكليوتيدات الجوانين - بتجنيد Raf ، وهو بروتين كيناز غير نشط يرتبط ب Ras عبر مجال ربط Ras.

ينتج عن هذا الربط مركب Ras-Raf وظيفي يؤدي إلى عملية إرسال الإشارات النهائية.

لتصور تفاعل Ras-Raf داخل الخلايا ، ابدأ بتعليق الخلايا المعدلة وراثيا في شريحة جيدة الغرفة. تعبر هذه الخلايا عن بروتينين اندماجيين غير فلوريين - أحدهما يشتمل على Ras المرتبط بنصف فلوروفور قابل للتنشيط الضوئي عبر طرفه N ، والآخر عبارة عن Raf مدمج في النصف الآخر من نفس الفلوروفور في طرفه C.

داخل الخلايا ، ترسو بروتينات الاندماج المحتوية على Ras في غشاء البلازما وتتفاعل مع بروتينات الاندماج المحتوية على Raf ، مما يعيد تكوين شظايا البروتين الفلوري إلى فلوروفور كامل قابل للتنشيط الضوئي. يحافظ غياب ربط Ras و Raf على فصل نصفي الفلوروفور.

أضف كاشف مثبت إلى الشريحة. تشكل جزيئات التثبيت روابط متبادلة مع البروتينات وتعمل على تثبيت مجمعات البروتين.

قم بإزالة الكاشف المثبت وإضافة مخزن مؤقت للتصوير. ضع الشريحة تحت مجهر مضان لفحص التوطين المنشط ضوئيا، PALM. قم بإضاءة الخلايا بليزر عالي الكثافة ، مما يؤدي إلى تنشيط مجموعة فرعية صغيرة من جزيئات الفلورسنت.

تخيل التألق الذي ينشئ عشوائيا والذي ينتجه كل مركب Ras-Raf أحادي الحجم بحجم النانو وعلامة الفلوروفور ، وا