مقايسة تحول الحركة الكهربية للكشف عن مجمعات عامل النسخ - الحمض النووي

تتعرف البروتينات التنظيمية ، مثل عوامل النسخ ، على تسلسل الحمض النووي المحدد وترتبط به في مناطق المحفز ، وتنظم التعبير الجيني.

للكشف عن تفاعلات عامل النسخ والحمض النووي المحددة باستخدام مقايسة تحول الحركة الكهربية ، ابدأ بأنبوب يحتوي على عامل النسخ المطلوب ومجسات DNA قصيرة محددة ، بالأشعة تحت الحمراء ، وصبغة الفلورسنت في مخزن مؤقت ملزم. احتضن في الظلام ، ومنع التبييض الضوئي للصبغة.

توفر القوة الأيونية ودرجة الحموضة للمخزن المؤقت ظروفا مناسبة لعامل النسخ لتحديد وربط تسلسلات ربط محددة على مسبار الحمض النووي. تعمل أيونات المغنيسيوم الموجودة في المخزن المؤقت على استقرار مجمعات البروتين والحمض النووي.

أضف صبغة تحميل مناسبة إلى الخليط ، مما يساعد على تصور تطور الرحلان الكهربائي. قم بتحميل هذا الخليط ومجسات الحمض النووي في آبار جل بولي أكريلاميد مسبقة الصب وغير متغير الطبيعة.

إجراء الرحلان الكهربائي في الظلام.

يتسبب المجال الكهربائي المطبق في انخفاض الوزن الجزيئي ، ومجسات الحمض النووي غير المنضمة ، والسالبة الشحنة للتحرك عبر الهلام نحو الأنودات الموجبة الشحنة. ومع ذلك ، فإن مجمعات مسبار البروتين والحمض النووي الكبيرة - ذات الوزن الجزيئي الأعلى - تهاجر ببطء ، مما يؤدي إلى تأخر الهجرة والتحول في حركة الحمض النووي في الجل.

بعد الرحلان الكهربائي ، قم بمسح الجل باستخدام نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء ، وتصور مجسات الحمض النووي ذات الصبغة الفلورية بالأشعة تحت الحمراء.

يوجد شريط مسبار الحمض النووي الحر في الجزء السفلي من الجل ، بينما تظهر مجمعات البروتين والحمض النووي كشريط متحول على الجل ، مما يشير إلى تكوين مركب البروتين والحمض النووي.

قم بإعداد 1 ملليلتر من مخزن مؤقت ملزم 5X عن طريق خلط Tris-HCl ، وكلوريد الصوديوم ، وكلوريد البوتاسيوم ، وكلوريد المغنيسيوم ، و EDTA ، DTT ، BSA ، والماء المقطر المزدوج.

قبل إعداد تفاعلات الربط ، قم بتشغيل جل بولي أكريلاميد الأصلي بنسبة 5٪ مسبقا في 0.5X TBE و 2.5٪ جلسرين لإزالة جميع آثار بيرسلفات الأمونيوم عند 80 فولت لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة أو حتى لا يتغير التيار بمرور الوقت.

بعد ذلك ، امزج 4 ميكرولترات من مخزن مؤقت ملزم 5X ، و 80 إلى 200 نانوجرام من البروتين المنقى A ، و 1 ميكرولتر من مسبار مترافق بالصبغة 0.1 ميكرومولار ، وماء مقطر مزدوج. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة.

بعد الحضانة ، قم بتحميل كل تفاعل الربط على الجل ، وقم بتشغيل الجل عند 10 فولت لكل سنتيمتر إلى المسافة المطلوبة. قم بتغطية جهاز الجل بالألمنيوم للحفاظ على الجل في الظلام قدر الإمكان.

نظف سرير الماسح الضوئي من نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء بالماء المقطر. جفف الألواح الزجاجية التي تحتوي على الجل وضعيها على سرير الماسح الضوئي. افتح برنامج التصوير بالأشعة تحت الحمراء ، وانقر على علامة التبويب "اكتساب".

بالنسبة لللوحات السميكة، استخدم إعدادات "700" ل "القناة" و"تلقائي" ل "الكثافة" و"84 ميكرومتر" ل "الدقة" و"متوسطة" ل "الجودة" و"3.5 ملليمتر" ل "إزاحة التركيز البؤري". حدد المنطقة التي يشغلها الجل على الماسحة الضوئية. أخيرا ، انقر فوق "ابدأ" لبدء الفحص.