الترسيب المناعي للكروماتين لتحديد مواقع ربط البروتين المستهدف على الحمض النووي الجيني

لتحديد مواقع الارتباط للبروتين المستهدف على الحمض النووي ، ابدأ بخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن التي تحتوي على بروتين مستهدف مرتبط بتسلسلات محددة من الحمض النووي في الكروماتين.

عالج الخلايا بمحلول تحلل يحتوي على مثبطات الإنزيم البروتيني. يعمل المخزن المؤقت للتحلل على تحلل الخلايا ، بينما تقوم المثبطات بتعطيل البروتياز للاحتفاظ بسلامة مجمعات البروتين والكروماتين.

قم بتقطيع المحتوى لقص المجمعات إلى أجزاء كروماتين أصغر ، مع الاحتفاظ ببعضها بالبروتين المستهدف.

جهاز طرد مركزي لحبيبات مكونات الخلية ، ونقل المادة الطافية التي تحتوي على شظايا الكروماتين إلى أنبوب جديد. احتضان بالأجسام المضادة المستهدفة التي ترتبط على وجه التحديد بالبروتين المستهدف على شظايا الكروماتين.

استكمل الأنبوب بخرز مغناطيسي مغلف بالبروتين A يرتبط بمنطقة Fc من الأجسام المضادة المرتبطة مسبقا. تطبيق مجال مغناطيسي لترسيب البروتينات المستهدفة المرتبطة بالأجسام المضادة بشكل انتقائي مع شظايا الكروماتين.

عالج مجمعات الخرز بمحلول شطف يحتوي على نسبة عالية من الملح لتعطيل تفاعلات البروتين والكروماتين وإطلاق الحمض النووي العاري بدون بروتينات مرتبطة بها.

استخدم المذيبات العضوية لاستخراج الحمض النووي. أضف مخزن مؤقت للتضخيم ، وقم بتشغيل تفاعل متسلسل للبوليميراز لتضخيم شظايا الحمض النووي. بعد التضخيم ، تحليل تسلسل الحمض النووي.

قارن تسلسل المنتجات المضخمة بتسلسل الحمض النووي الجيني للخلية. ابحث عن المنطقة ذات التطابق التسلسلي بين الجزء والحمض النووي الجيني - المرتبطة بمواقع ربط البروتين.

بعد العد في مقياس كثافة الدم ، أضف 20,000 OPCs منقاة في 1 مليلتر من وسط ثقافة الخلايا OPC لتفاعل ChIP. ثم أضف 27 ميكرولترا من 36.5٪ من الفورمالديهايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. سيؤدي ذلك إلى إصلاح الخلايا.

بعد 10 دقائق ، أضف 50 ميكرولترا من 2.5 مولار جلايسين على الخلايا الثابتة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ستؤدي إضافة الجلايسين إلى إيقاف تشابك البروتين بين الحمض النووي. بعد ذلك ، اغسل الخلايا المتشابكة ب 1 مليلتر من المخزن المؤقت HBSS باستخدام كوكتيل مثبط للبروتين. بعد ذلك ، قم بعمل الطرد المركزي للخلايا في آلة طرد مركزي مبردة مسبقا عند 300 مرة جم عند 4 درجات مئوية.

بعد الربط المتبادل ل OPCs المنقاة ، يجب غسل الخلايا المتشابكة باستخدام محلول HBSS المثلج ، ويجب تنفيذ خطوات ChIP المتبقية عند 4 درجات. خلاف ذلك ، لا يمكن للجسم المضاد ترسيب الحمض النووي الجيني بشكل صحيح.

ثم أضف 25 ميكرولترا من محلول التحلل الكامل إلى حبيبات الخلية واتركها على الجليد لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بتعبئة ماصة 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBSS المثلج مع كوكتيل مثبط للبروتين. بعد ذلك ، قم بقص الكروماتين في محللة الخلية في نظام صوتنة مبرد مسبقا مع خمس دورات من 30 ثانية ON و 30 ثانية OFF البرنامج.

بمجرد قص الكروماتين ، قم بعمل طرد مركزي للخلية عند 14,000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. في نهاية الطرد المركزي ، اجمع المادة الطافية. بعد ذلك ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من الكروماتين المنفصم بحجم متساو من المخزن المؤقت ChIP المثلج البارد مع مثبط البروتين.

بعد ذلك ، أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للأربنب المضاد للأوليج 2 إلى 180 ميكرولتر من الكروماتين المخفف المنفصم. احتضان الأنابيب على عجلة دوارة لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية بمعدل 40 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من حبات البروتين المطلية بالبروتين A المغسولة مسبقا إلى أنبوب تفاعل ChIP في غرفة باردة. مرة أخرى ، احتضان أنابيب ChIP عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين أخريين على العجلة الدوارة.

بعد ساعتين ، اترك أنبوب تفاعل ChIP على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة. بعد ذلك ، اغسل حبيبات الخرزة ب 100 ميكرولتر من أربعة مخازن غسيل لكل منها لمدة 4 دقائق على عجلة دوارة عند 4 درجات مئوية. ثم أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف إلى حبيبات الخرزة. احتضان أنبوب التفاعل عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.

بمجرد تغيير طبيعة الحمض النووي المزدوج الشريطة ، قم بإزالة الفوسفورة من الطرف المكون من 3 أوائل للحمض النووي أحادي الخيط عن طريق إضافة فوسفاتيز الجمبري القلوي. بعد ذلك ، أضف ذيل بولي (T) إلى الحمض النووي أحادي الشريطة باستخدام ديوكسي نوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي. بعد ذلك ، قم بتلدين التمهيدي DNA poly-(dA) إلى قالب الحمض النووي أحادي الشريطة. بعد ذلك ، قم بتضخيم مكتبة تسلسل ChIP باستخدام الاشعال الأمامية والخلفية للفهرسة.

عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل لإعداد المكتبة على مقدار الحمض النووي الأولي. يتطلب الإعداد الجيد للمكتبة تقديرا كميا دقيقا لكمية الحمض النووي للإدخال. يمكن أن تؤثر دورات PCR العديدة أو القليلة جدا على تركيز المكتبة بالإضافة إلى التعقيد ، مما يؤدي إلى قطع أثرية PCR.

استخدم الخرز المغناطيسي لتحديد الأجزاء التي تتراوح من 250 إلى 500 زوج أساسي من مكتبة تسلسل ChIP المضخمة ب PCR. استخدم جهاز الرحلان الكهربائي الشعري ChIP الموائع الدقيقة لفحص جودة مكتبة تسلسل ChIP المحددة.