مقايسة قمع الجينات المراسل لدراسة التنظيم الانتقالي للجين المستهدف

تعمل

البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي ، RBPs ، كمنظمات ما بعد النسخ من خلال الارتباط بمنطقة بدء الترجمة ، TIR ، من mRNA وقمع الترجمة.

لدراسة تفاعلات الحمض النووي الريبي-RBP عن طريق القمع الانتقالي لجين المراسل ، خذ مزرعة خلية بكتيرية تحتوي على بلازميدين - موقع الارتباط وبلازميدات RBP.

يقوم

بلازميد موقع الربط بتشفير جين مراسل الفلورسنت. عند النسخ ، يحتوي TIR الخاص ب mRNA الناتج على موقع ربط الريبوسوم وهيكل دبوس الشعر ، مع تسلسل معترف به بواسطة RBPs.

ترتبط الريبوسومات بموقع الارتباط على الرنا المرسال وتزعزع استقرار بنية دبوس الشعر ، مما يؤدي إلى ترجمة الرنا المرسال وتكوين بروتين مراسل الفلورسنت. يعبر بلازميد RBP عن RBP خيميري مدمج في بروتين فلوري مختلف. يتحكم المحفز المحفز في تعبير البروتين الخيمري.

أضف المحفز ، الذي ينشط عامل النسخ الذي يرتبط بالمروج ، مما يؤدي إلى تعبير البروتين الخيمري. يرتبط RBP للبروتين الخيمري ببنية دبوس الشعر. هذا يمنع الريبوسوم من الارتباط ب mRNA ، مما يمنع ترجمة بروتين المراسل.

مع زيادة تركيز المحفز ، يزداد إنتاج RBP ، مما يؤدي إلى تثبيط تنافسي أقوى لارتباط الريبوسومات ب mRNA.

قم بقياس إشارات التألق المختلفة من البروتينات الوهمية والمراسلة. ارسم الإشارات ، واحصل على منحنى الاستجابة للجرعة.

مع الزيادة بوساطة المحفز في إنتاج RBP ، يقلل القمع الانتقالي من تركيز بروتين المراسل ، مما يؤكد تفاعل RNA-RBP.

قم بتحويل البلازميدات المحضرة إلى خلايا بكتيرية مختصة كيميائيا تحتوي بالفعل على بلازميد RBP-mCerulean. لتوفير الوقت ، قم بوضع الخلايا باستخدام ماصة ذات 8 قنوات على ألواح من 8 حارات تحتوي على أجار لوريا بيرتاني مع المضادات الحيوية ذات الصلة. يجب أن تظهر المستعمرات في غضون 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.

حدد مستعمرة واحدة لكل محول مزدوج وانقلها إلى 48 بئرا تحتوي على 1.5 مل من LB مع المضادات الحيوية المناسبة. قم بتنمية الخلايا على مدى 18 ساعة عند 37 درجة مئوية تهتز عند 250 دورة في الدقيقة. قم بتخزين مخزون الجلسرين لليلة واحدة عند -80 درجة مئوية في 96 بئرا.

في الصباح ، قم ببرمجة الروبوت لتسخين 180 ميكرولترا من الوسط شبه الفقير ، أو SPM ، في 96 لوحا بئرا. قم ببرمجة الروبوت لإعداد لوحة المحفز.

في صفيحة نظيفة من 96 بئرا ، قم بإعداد الآبار مع SPM التي تتكون من 95٪ BA و 5٪ LB. يتوافق عدد الآبار مع العدد المطلوب من تركيزات المحفز. أضف C4-HSL إلى الآبار الموجودة في لوحة المحفز التي ستحتوي على أعلى تركيز محفز.

بعد ذلك ، قم ببرمجة الروبوت لتخفيف الوسط بشكل متسلسل من كل بئر من أعلى بئر تركيز إلى 23 تركيزا أقل تتراوح من 0 إلى 218 نانومولار. يجب أن يكون حجم كل تخفيف محفز كافيا لجميع السلالات.

لتخفيف السلالات الليلية ، قم ببرمجة الروبوت للتخفيف بمعامل 10 عن طريق خلط 20 ميكرولترا من البكتيريا مع 180 ميكرولترا من SPM في ألواح 48 بئرا. بعد ذلك ، قم بالتخفيف مرة أخرى بمعامل 10 عن طريق أخذ 20 ميكرولترا من المحلول المخفف إلى لوحة الإجهاد المعدة مسبقا والمناسبة لقياسات الفلورسنت.

الآن ، قم ببرمجة الروبوت لإضافة المحفز المخفف من لوحة المحفز إلى الألواح المكونة من 96 بئرا مع السلالات المخففة وفقا للتركيزات النهائية. رج الألواح المكونة من 96 بئرا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات. خلال ذلك الوقت ، خذ قياسات الكثافة الضوئية أو OD عند 595 نانومتر ، بالإضافة إلى mCherry و mCerulean المضان عبر قارئ الألواح كل 30 دقيقة.