الاختبار الهجين المعدل للخميرة الواحدة للكشف عن تفاعلات الحمض النووي المركب للبروتين غير المتجانس
موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 4:12 دقيقة • July 8th, 2025
للكشف عن التفاعلات بين مجمعات البروتين غير المتجانسة التي تتضمن بروتينات متعددة مع الحمض النووي المستهدف باستخدام مقايسة الخميرة المعدلة أحادية الهجين ، خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على التركيز المطلوب لزراعة خلايا الخميرة المتحولة بنشاط.
تحتوي هذه الخلايا على تسلسل محدد للحمض النووي في المنبع من الجين المشفر للمراسل β-galactosidase ، مدفوعا بمحفز GAL-4 ، بينما يفتقر إلى بروتين عامل النسخ GAL-4 الداخلي. تعبر الخلايا عن بروتين مستهدف مدمج في مجال تنشيط GAL-4 وبروتين آخر يفتقر إلى مجال ربط الحمض النووي GAL-4.
إذا تفاعلت هذه البروتينات ، فيمكن أن تشكل مركبا ، مما يمكن البروتين المستهدف من الارتباط بتسلسل الحمض النووي في منطقة محفز جين المراسل. ينشط مجال تنشيط GAL-4 تعبير إنزيم β-galactosidase المراسل.
الطرد المركزي. أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت مناسب. قم بتجميد الخلايا وإذابتها لتحللها وإطلاق β-galactosidase. أضف بيتا ميركابتو إيثانول ومخزن مؤقت يحتوي على ركيزة β-galactosidase.
يعملبيتا ميركابتو إيثانول على استقرار إنزيم β-galactosidase. يقوم β-galactosidase بتحلل ركيزة β-galactosidase ، مكونا كروموجين أصفر.
أضف محلول كربونات الصوديوم لتشويه β-galactosidase وإيقاف التفاعل. الطرد المركزي. انقل المادة الطافية التي تحتوي على كروموجين أصفر إلى صفيحة متعددة الآبار. باستخدام قارئ اللوحة
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية