الاختبار الهجين المعدل للخميرة الواحدة للكشف عن تفاعلات الحمض النووي المركب للبروتين غير المتجانس

للكشف عن التفاعلات بين مجمعات البروتين غير المتجانسة التي تتضمن بروتينات متعددة مع الحمض النووي المستهدف باستخدام مقايسة الخميرة المعدلة أحادية الهجين ، خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على التركيز المطلوب لزراعة خلايا الخميرة المتحولة بنشاط.

تحتوي هذه الخلايا على تسلسل محدد للحمض النووي في المنبع من الجين المشفر للمراسل β-galactosidase ، مدفوعا بمحفز GAL-4 ، بينما يفتقر إلى بروتين عامل النسخ GAL-4 الداخلي. تعبر الخلايا عن بروتين مستهدف مدمج في مجال تنشيط GAL-4 وبروتين آخر يفتقر إلى مجال ربط الحمض النووي GAL-4.

إذا تفاعلت هذه البروتينات ، فيمكن أن تشكل مركبا ، مما يمكن البروتين المستهدف من الارتباط بتسلسل الحمض النووي في منطقة محفز جين المراسل. ينشط مجال تنشيط GAL-4 تعبير إنزيم β-galactosidase المراسل.

الطرد المركزي. أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت مناسب. قم بتجميد الخلايا وإذابتها لتحللها وإطلاق β-galactosidase. أضف بيتا ميركابتو إيثانول ومخزن مؤقت يحتوي على ركيزة β-galactosidase.

يعمل

بيتا ميركابتو إيثانول على استقرار إنزيم β-galactosidase. يقوم β-galactosidase بتحلل ركيزة β-galactosidase ، مكونا كروموجين أصفر.

أضف محلول كربونات الصوديوم لتشويه β-galactosidase وإيقاف التفاعل. الطرد المركزي. انقل المادة الطافية التي تحتوي على كروموجين أصفر إلى صفيحة متعددة الآبار. باستخدام قارئ اللوحة ، قم بقياس الكثافة الضوئية للمحلول بطول موجي مناسب لحساب نشاط β-galactosidase.

يشير ارتفاع نشاط β-galactosidase إلى تفاعلات إيجابية بين البروتينات وتسلسل الحمض النووي المستهدف ، مما يؤدي إلى تعبير β-galactosidase.

أعد تعليق الثقافة ، وانقل 125 ميكرولترا من كل بئر إلى لوحة مقياس الطيف الضوئي. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر للتأكد من أنها تتراوح بين 0.3 و 0.6. الطرد المركزي للخلايا المتبقية في كتلة البئر العميقة عند 3,000 مرة جم و 21 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلبها.

أضف 200 ميكرولتر من Z-buffer إلى كل بئر ودوامة. جهاز طرد مركزي عند 3,000 مرة جم و 21 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلبها. أضف 20 ميكرولترا من Z-buffer إلى كل بئر ودوامة. قم بتغطية اللوحة بورق مانع للتسرب مقاوم لدورات التجميد والذوبان.

في غطاء الدخان ، قم بإجراء أربع دورات من التجميد والذوبان باستخدام النيتروجين السائل في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة مئوية. أضف 200 ميكرولتر من محلول Z-buffer / beta-mercaptoethanol / ONPG المحضر حديثا إلى كل بئر. احتضن عند 30 درجة مئوية لمدة 17 إلى 24 ساعة أو حتى يتطور اللون. تأكد من تطور اللون.

أضف 110 ميكرولتر من 1 كربونات الصوديوم المولار إلى كل بئر لإيقاف التفاعل. سجل الوقت ، وقم بتدوير اللوحة. جهاز طرد مركزي عند 3,000 مرة جم و 21 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 125 ميكرولترا من المادة الطافية من كل بئر إلى لوحة مقياس الطيف الضوئي. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 420 نانومتر.