JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 4:10 د • July 8th, 2025
يمكن أن تساعد البروتينات ذات نشاط الهيليكاز الحمض النووي الريبي في استرخاء وفصل جزيئات الحمض النووي الريبي الفردية في ازدواج الحمض النووي الريبي.
لتحديد نشاط الهليكاز للبروتين ، خذ أنابيب تحتوي على مزيج من دوبلكس الحمض النووي الريبي المسمى بالبيوتين مع مصائد 5 بوصات متدلية و ATPs و RNA - خيوط غير مصنفة مكملة للخيوط الحيوية للدوبلكس.
أضف البروتين مع نشاط الهليكاز إلى كل أنبوب واحتضانه لفترات مختلفة. يرتبط البروتين ب 5 's duplexs المتدلية.
باستخدام جزيئات ATP ، فإنه يكسر الروابط الهيدروجينية بين خيطين مزدوجين ، مما يؤدي إلى فكها وإطلاق الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة الحيوي. تتفاعل مصائد الحمض النووي الريبي مع الخيوط المسماة بالبيوتين ، مما يمنع إعادة التلدين بالخيوط المنفصلة.
قم بإنهاء التفاعل باستخدام مخزن مؤقت للإنهاء.
قم بتحميل العينات في آبار مختلفة من هلام بولي أكريلاميد الأصلي. تشغيل الرحلان الكهربائي. يتحرك الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة منخفض الوزن الجزيئي بشكل أسرع من الأحجار المزدوجة ذات الوزن الجزيئي المرتفع. يولد هذا التحول في التنقل شريطين متميزين.
امسح الجل على غشاء نايلون ، وانقل الحمض النووي الريبي إلى الغشاء. بعد النشاف ، قم بتعريض الغشاء لضوء الأشعة فوق البنفسجية ، وربط الحمض النووي الريبي بالغشاء.
أضف الستربتافيدين المترافق بالإنزيم الكيميائي ، والذي يتفاعل مع البيوتين على الفتحات المزدوجة والخيوط أحادية الشريطة. استخدم ركائز كيميائية لإنتاج منتجات التلألؤ الكيميائي.
عند التصوير ، تزداد شدة الشريط منخفض الوزن الجزيئي بمرور الوقت ، وترتبط بنشاط الهيليكاز للبروتين المستهدف.
بالنسبة لمقايسة نشاط الهليكاز MOV10 ، امزج الكواشف وفقا لتوجيهات المخطوطة ، وأضف الماء للحصول على حجم تفاعل نهائي يبلغ 20 ميكرولترا. احتضن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و30 دقيقة و60 دقيقة، ثم أضف 5X Stop Buffer لإيقاف التفاعل. بعد ذلك ، قم بإعداد جل بولي أكريلاميد أصلي بنسبة 20٪ وقم بتحميل 20 إلى 25 ميكرولترا من كل عينة في كل بئر. قم بتشغيل الجل على حرارة 100 فولت في حمام جليدي حتى تنتقل علامة البروموفينول الزرقاء إلى الربع السفلي من الجل.
مادة الأكريلاميد ضارة وسامة. من المهم التعامل معها باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.
قمبتفكيك ألواح الجل وتقليم الجل عن طريق إزالة آبار التحميل والممرات غير المستخدمة. ضع الجل في المخزن المؤقت 0.5X TBE. قم بقص ورق الترشيح وغشاء النايلون بحجم الجل ، وقم بترطيب الورق والغشاء مسبقا ، وقم بتجميع المكدس لنقله.
انقل العينات من الجل إلى الغشاء في جهاز كهربائي شبه جاف عند 90 مللي أمبير لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بربط العينات عن طريق تشعيع الغشاء عند 120 مللي جول لكل سنتيمتر مربع لمدة 45 إلى 60 ثانية.
للكشف عن التلألؤ الكيميائي ، ابدأ بإضافة 20 مل من المخزن المؤقت للحجب إلى الغشاء واحتضانه لمدة 15 إلى 30 دقيقة أثناء الاهتزاز برفق. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر بعناية ، واستبدله بمخزن مؤقت للحجب المترافن. احتضان الغشاء مرة أخرى لمدة 15 دقيقة.
اغسل الغشاء أربع مرات مع رجه لمدة 5 دقائق لكل غسلة. ثم أضف 30 مل من المخزن المؤقت لتوازن الركيزة إلى الغشاء ، واحتضنه لمدة 5 دقائق مع الاهتزاز بسرعة 20 إلى 25 دورة في الدقيقة.
قم بتغطية سطح الغشاء بالكامل بمحلول عمل الركيزة واحتضانه لمدة 5 دقائق. بعد الحضانة ، قم بمسح الغشاء في نظام تصوير كيميائي لمدة 1 إلى 3 ثوان.