التصور القائم على التألق المناعي لتفاعلات بروتين إصلاح الحمض النووي

فواصل الحمض النووي المزدوجة الناجمة عن الإشعاع ، أو DSBs ، في تجنيد بروتين إصلاح الحمض النووي في الموقع التالف - مما يؤدي إلى تنشيط إصلاح الحمض النووي.

للكشف عن بروتينات إصلاح الحمض النووي γH2AX و 53BP1 في مواقع DSB باستخدام التألق المناعي غير المباشر ، خذ أغطية تحتوي على خلايا ظهارية. تشعيع مجموعة فرعية من الخلايا. احتضان ، مما يسمح للتحكم بالخلايا غير المشعة والمشععة بالنمو لأوقات محددة.

عالج بمخزن مؤقت لاستخراج نوى الخلية. قم بإصلاح نوى الخلية للحفاظ على مورفولوجيتها. عالج بمحلول مانع لتقليل ارتباط الأجسام المضادة الأولية غير المحددة.

أضف الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف بروتيني إصلاح الحمض النووي. ترتبط الأجسام المضادة بالبروتينات المعنية.

احتضن بالأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلوروفورات الحمراء والخضراء ، على التوالي. ترتبط الأجسام المضادة الثانوية - الخاصة بكل جسم مضاد أولي - بأهدافها. أضف وسيط التثبيت الذي يحتوي على DAPI على شريحة زجاجية. قم بتركيب الغطاء عليه للتصوير.

ترتبط DAPI - صبغة ملزمة للحمض النووي - بالأخاديد الصغيرة الغنية ب AT للحمض النووي المزدوج الشريطة ، مما يؤدي إلى تلطيخ النوى. تصور نوى الخلية باستخدام المجهر الفلوري.

بالمقارنة مع نوى الخلايا غير المشعة ، تظهر النوى المشعة بؤر γH2AX متعددة تتناقص بمرور الوقت ، مما يشير إلى إصلاح الحمض النووي التدريجي في الخلايا المزروعة لفترات أطول.

تظهر إشارات التألق الأحمر والأخضر المتداخلة باللون الأصفر ، مما يشير إلى التوطين المشترك ل γH2AX و 53BP1 في موقع DSB بعد التشعيع.

ابدأ بزراعة 40,000 خلية HeLa في كل بئر من صفيحة 12 بئرا مع غطاء زجاجي دائري مقاس 18 ملم إلى 80٪ من التقاء. بعد تعريض الخلايا لإشعاع جاما رمادي 4 ، اغسلها مرتين باستخدام 1 ملليلتر من PBS. بعد ذلك ، قم بإزالة PBS تماما ، وأضف 200 ميكرولتر من NEB إلى كل بئر. احتضان الخلايا لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة NEB.

ضع في اعتبارك أن وقت الحضانة يمكن أن يختلف اعتمادا على خط الخلية ، ولكن بشكل عام يجب ألا يتجاوز دقيقتين. اغسل الخلايا ب 1 ملليلتر من PBS. بعد ذلك ، قم بإزالة PBS تماما ، وأضف 200 ميكرولتر من 4٪ PFA إلى كل بئر لتثبيت الخلايا.

احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم قم بإزالة PFA وأضف 1 مليلتر من PBS إلى كل بئر. قم بإزالة PBS تماما ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول الحجب لكل بئر ، واحتضن الخلايا لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، أو 16 إلى 18 ساعة عند 4 درجات مئوية.

بتخفيف الجسم المضاد الأساسي في المخزن المؤقت للتخفيف ، وقم بتدويره حتى يمتزج جيدا. في صندوق الرطوبة ، قم بلصق قطعة من البارافيلم ، وأضف 10 ميكرولترات من الجسم المضاد الأساسي في قطرة واحدة. قم بمحاذاة إحدى حواف الغطاء من البئر مع القطرة ، وخفضها ببطء على البارافيلم ، وانشر السائل. احتضان الغطاء لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة ، اغسل الغطاء ثلاث مرات في PBS لمدة 1 دقيقة لكل غسلة. تمييع الجسم المضاد الثانوي في المخزن المؤقت للتخفيف والدوامة حتى يمتزج جيدا. ضع 10 ميكرولترات من الجسم المضاد الثانوي على كل غطاء كما هو موضح سابقا ، واحتضنه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، محميا من الضوء.

اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS - ومرة واحدة بالماء - لمدة دقيقة واحدة لكل غسلة. بعد ذلك ، قم بتثبيتها على شرائح زجاجية باستخدام وسائط تثبيت قائمة على الجلسرين تحتوي على DAPI. أغلق الأغطية بطلاء أظافر شفاف ، واتركها تجف لمدة 20 دقيقة. ضع قطرة من زيت الغمر على العدسة الموضوعية 60X ، واستخدم DAPI لتحديد موقع النوى من خلال العدسة.

للحصول على صور XYZ ، افتح برنامج الاستحواذ واضبط "نوع الماسح الضوئي" على أنه "Galvano" ، و "وضع الماسح الضوئي" على أنه "رحلة ذهابا وإيابا" ، و "512 × 512" حجم الصورة. في لوحة PMT، اضبط الوضع على VBM، والمتوسط إلى الإطار، والمسح الضوئي المتسلسل إلى Line. بعد ذلك ، اضبط كاشفات الصبغة والحرارة. اضبط القناة 1 على DAPI و SD1 ، والقناة الثانية إلى Alexa Fluor 488 و HSD3 ، والقناة 3 إلى Alexa Fluor 647 و HSD4. حدد "ON" في "Z".

لضبط الصورة الحية، اضغط على الزر Live في Live Window واضبط التركيز. بعد ذلك ، استخدم نافذة "أداة PMT" لضبط شدة الليزر والحساسية والكسب والإزاحة. بالنسبة لمكدسات Z، حدد من البداية إلى النهاية و 15 شريحة. حدد المجلد لحفظ الصور ، واضغط على LSM ابدأ زر لبدء الاستحواذ. عند الانتهاء، اضغط على زر Series Done لإكمال الحصول على الصورة.