الرحلان الحراري المجهري لدراسة تفاعلات البروتين والدهون في المحلول

لدراسة تفاعل البروتينات مع جزيئات الدهون ، ابدأ بأنبوبين شعريين. أضف بروتينات الاختبار ذات العلامات الفلورية في كلا الأنبوبين وجزيئات الدهون غير المسماة إلى أحدهما. ضع هذه الشعيرات الدموية في مصفوفة وضعها داخل أداة الرحلان الحراري المجهري.

قم بإشعاع الشعيرات الدموية المحتوية على البروتين بضوء الأشعة تحت الحمراء المركز ، مما يؤدي إلى ارتفاع درجة الحرارة في البقعة البؤرية التي تنتشر عبر المحلول ، مما يؤدي إلى توليد تدرج في درجة الحرارة داخل منطقة ضيقة تحتوي على بروتينات ذات علامات فلورسنت.

يجمع كاشف التألق إشارة التألق من نفس بقعة الشعيرات الدموية — حيث يتم تركيز الليزر. يقوم المعالج بتحويل الإشارة وإنشاء مخطط للتألق النسبي كدالة للوقت.

في تدرج درجة الحرارة ، تبدأ البروتينات المسماة في الهجرة من المنطقة الأكثر سخونة إلى المنطقة الأكثر برودة ، مما يؤدي إلى ظهور الحرارة - وهي ظاهرة الهجرة المعتمدة على درجة الحرارة.

بسبب الرحلان الحراري ، تقل شدة التألق تدريجيا بمرور الوقت وتصل إلى حالة مستقرة ، حيث تصل البروتينات المسماة إلى التوازن.

تشعيع الشعيرات الدموية المحتوية على مزيج البروتين والدهون ، مما يؤدي إلى تكوين تدرج في درجة الحرارة.

أثناء الرحلان الحراري ، تتفاعل البروتينات المهاجرة المسماة مع جزيئات الدهون ، وتشكل مجمعات بروتينية دهنية ذات كتل جزيئية أعلى. هذا يؤدي إلى تأخر حركتهم.

تسبب هذه الهجرة التفاضلية تحولا في التألق ، مما يؤكد التفاعل الناجح بين البروتين والدهون.

قبل البدء في التحليل ، قم بتشغيل مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من جهاز MST ، وافتح برنامج التحكم. تأكد من توصيل الكمبيوتر بالجهاز وفي حالة "متصل"، واضبط MST قبل على 3 ثوان، وMST على 30 ثانية، واسترداد التألق على بعد ثانية واحدة.

لكل أنبوب شعري، أدخل اسم الترابط المستهدف، واسم المادة التحليلية للترابط، وتركيز الهدف، وأعلى تركيز للمعايرة باستخدام نسبة المعايرة بالتحليل الحجمي للتعبئة التلقائية. حدد نطاقا من قوى MST وأدخل قيم كل طاقة لاختبار أقوى ملاءمة ملزمة.

لتحضير عينات MST المصنفة ، قم بتخفيف محلول Vam7-octahistidine إلى تركيز 200 نانومولار وصبغة NTA-Atto 647 بتركيز 100 نانومولار ، وكلاهما في PBS. امزج Vam7-octahistidine وصبغة NTA-Atto 647 بنسبة حجمية من 1 إلى 1 ، واترك الخليط يجلس في درجة حرارة الغرفة ، محميا من الضوء ، لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي لخليط الصبغة والبروتين ، وقم بتخزين المحلول على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى بضع ساعات قبل الاستخدام. ثم قم بإعداد العينة. خذ الصبغة إلى الترابط وفضح المادة التحليلية.

بالنسبة للرحلان الحراري MicroScale للعينة ، افتح الجهاز وحرك الرف الشعري للخارج. قم بتحميل عينة الشعيرات الدموية في الحامل بأعلى تركيز في الموضع 1 ، وحدد القناة الحمراء في برنامج التحكم. ثم قم بتحميل الحامل في الأداة. بعد ذلك ، حدد نطاقا من طاقة MST وابدأ قياس Cap Scan + MST وقم بتقييم استجابة التحول.