JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 2:43 د • July 8th, 2025
تفاعلات البروتين والفوسفوليبيد على غشاء الخلية ضرورية لتنظيم العديد من العمليات الخلوية.
للكشف عن التفاعلات المستهدفة بين البروتين والفوسفوليبيد في المختبر باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي ، خذ أنبوبا يحتوي على التركيز المطلوب من تقليد غشاء الخلية - حويصلات الفوسفوليبيد المحبة للدهون بحجم ميكرون ، والمسماة بالصبغة - في المخزن المؤقت.
أضف تركيزا مناسبا من البروتينات المستهدفة المختلفة ذات العلامات الفلورية في المحلول.
حقن التعليق في مقياس التدفق الخلوي. اضبط معلمات نظام السوائل على معدل تدفق منخفض للسماح بوقت كاف لتفاعلات البروتين والفوسفوليبيد.
عندما تتفاعل البروتينات ذات العلامات الفلورية والحويصلات الفوسفوليبيد في قناة التدفق ، يزداد تركيز البروتينات المرتبطة بالحويصلات.
عندما تمر هذه المجمعات عبر أشعة الليزر من قنوات مضان محددة توفر أطوال موجية مناسبة ، فإنها تصبح متحمسة. تصدر هذه البروتينات المثارة والحويصلات الفوسفورية في المركب إشارات مضان ذات صلة عند الاسترخاء إلى الحالة الأرضية ، والتي يتم التقاطها بواسطة أجهزة الكشف المناسبة.
يدل اكتشاف متوسط شدة مضان مرتفع للبروتينات على ارتباط البروتين بحويصلات الفوسفوليبيد.
ابدأ تجارب الربط الحركي عن طريق تخفيف حويصلات الفوسفوليبيد في عازلة Tyrode إلى تركيز 1 ميكرومولار وحجم إجمالي يبلغ 250 ميكرولترا. بعد ذلك ، قم بخلط عامل التخثر المسمى بالفلورسنت X أو fX-fd بتركيز 500 نانومولار مع حويصلات الفوسفوليبيد بنسبة 1: 1 للحصول على حجم إجمالي يبلغ 500 ميكرولتر.
قمبحقن 500 ميكرولتر على الفور من التعليق المختلط في مقياس التدفق الخلوي بمعدل تدفق بطول موجي إثارة يبلغ 488 نانومتر ومرشح انبعاث 585 نانومتر بعرض 42 للقناة FL2.
بعد ذلك ، قم بقياس متوسط التألق في القناة FL4 مع الإثارة عند 633 نانومتر ومرشح الانبعاث عند 660 نانومتر بعرض 20. عندما يتحقق تشبع الربط ، قم بتخفيف العينة بسرعة 20 ضعفا باستخدام المخزن المؤقت Tyrode ، وراقب التفكك حتى يتم الوصول إلى مضان خط الأساس أو الهضبة.