مقايسة تعديل الأس الهيدروجيني على الطبقات الدهنية الثنائية المدعومة للكشف عن تفاعلات البروتين والفوسفوينوزيتيد

فوسفاتيديلينوسيتول 4،5-ثنائي الفوسفات, أو PIP2, هو فوسفوليبيد فسفري المرتبط بالغشاء البسيط. يرتبط Phospholipase C ، أو PLC ، مع مجالات ربط PIP2 محددة ، ب PIP2 ، مما يولد رسل ثانويين ضروريين للعديد من العمليات الخلوية.

للكشف عن تفاعلات PLC-PIP2 في المختبر ، ابدأ بحويصلة صغيرة أحادية الصفيحة ، وسيارات الدفع الرباعي ، وتعليق حمضي ، يتألف من PIP2 وخليط فوسفوليبيد ، أحدهما مترافق مع صبغة فلورية حساسة للأس الهيدروجيني.

قم بعرض المحلول في مدخل جهاز ميكروفلويديك مجمع مسبقا وتوصيل أنبوب المخرج. انقل الجهاز وقم بتثبيته على مرحلة المجهر الفلوري. من خلال الجاذبية ، تمر سيارات الدفع الرباعي عبر أرضية القناة الدقيقة ، المصنوعة من غطاء زجاجي محب للماء.

تمتص سيارات الدفع الرباعي على السطح الزجاجي ، ويقلل الرقم الهيدروجيني للمحلول من التنافر الكهروستاتيكي بين الاثنين. تتفاعل سيارات الدفع الرباعي مع السطح ، وتشوه وتندمج لتشكيل حويصلات كبيرة.

بعد تغطية السطح الحرجة ، تتمزق الحويصلات تلقائيا ، وتشكل طبقة ثنائية دهنية مدعومة ، SLB. قم بتمرير مخزن مؤقت عبر القناة ، وإزالة الحويصلات غير الممتزة.

باستخدام قناة مضان مناسبة ، قم بتصوير القناة الدقيقة لتصور وقياس مضان الصبغة الحساسة للأس الهيدروجيني - عالية الفلورسنت عند درجة حموضة منخفضة - في SLB.

أدخل حل PLC مؤتلف في القناة الدقيقة. الرقم الهيدروجيني المحايد للمحلول ، أسفل النقطة المتساوية الكهربية ل PLC ، يجعل PLC مشحونا إيجابيا.

يرتبط PLC المؤتلف ، بمجال ربط PIP2 ، ب PIP2 ، ويجند أيونات الهيدروكسيد سالبة الشحنة على سطح الطبقة الثنائية. هذا يجعل سطح الطبقة الثنائية أكثر أساسية ، مما يؤدي إلى تغيير حالة البروتون للصبغة ويسبب تبريد التألق ، مما يشير إلى تفاعلات PLC-PIP2.

نقل 100 ميكرولتر من فوسفاتيديل إينوزيتول-4 5-ثنائي الفوسفات الذي يحتوي على حويصلات أحادية الصفيحة صغيرة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.65 ملليلتر. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على 3.2 تقريبا عن طريق إضافة 6.4 ميكرولتر من 0.2 حمض الهيدروكلوريك العادي.

ماصة 10 ميكرولتر من محلول الحويصلة أحادية الصفيحة الصغيرة المعدلة بدرجة الحموضة في كل قناة من خلال المدخل والضغط من خلال الماصة حتى يصل المحلول إلى المخرج. افصل الطرف عن الماصة واتركه متصلا بالجهاز. بعد تكرار هذه الخطوة لكل قناة ، احتضن الجهاز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

يجب إجراء حقن الحويصلات في القنوات الدقيقة مباشرة بعد تجميع الجهاز. وفي الوقت نفسه ، قم بقطع مجموعات من أنابيب المدخل والمخرج. باستخدام الملقط ، قم بتوصيل مجموعة أنابيب المخرج بالجهاز ، ثم قم بلصق الجهاز على مرحلة المجهر.

اغمر أحد طرفي أنبوب المدخل في 25 مل من المخزن المؤقت الموجود في أنبوب مخروطي الشكل ، وقم بلصقه للتأكد من تأمين الأنبوب. باستخدام مقبس المختبر ، ضع الأنبوب المخروطي على أرضية أعلى من الجهاز من أجل دفع المحلول عبر القنوات الدقيقة عبر تدفق الجاذبية.

لكل أنبوب مدخل ، استخدم حقنة لسحب 1 مليلتر من المخزن المؤقت الجاري من الطرف الحر للأنبوب. قم بإزالة طرف الماصة من المدخل، وأدخل الطرف الحر لأنبوب المدخل في الجهاز. كرر هذه العملية لتوصيل جميع قطع أنابيب المدخل بالجهاز. يساعد المخزن المؤقت المتدفق عبر القنوات على إزالة الحويصلات الزائدة غير الممزقة وتوازن الطبقة الثنائية مع الظروف التجريبية.

بعد ذلك ، افتح برنامج التحكم في المجهر. في اللوحة اليسرى ، انقر فوق علامة التبويب "المجهر" واختر الهدف "10x". انقر فوق "مباشر" ، ثم أيقونات الصور "Alexa 568" على شريط الأدوات. باستخدام مقابض الضبط الدقيقة والخشنة ، ركز على القنوات الدقيقة. امسح ضوئيا من خلال الجهاز للتحقق من جودة SLBs والقنوات.

ثم انقر فوق رمز الصورة "FL Shutter Closed" على شريط الأدوات. انقر فوق علامة التبويب "اكتساب" ، وضمن "التعديلات الأساسية" ، حدد وقت التعرض. اضبط وقت التعرض على 200 مللي ثانية. في اللوحة اليسرى ، انقر فوق "اكتساب متعدد الأبعاد". ضمن قائمة "الفلاتر"، اختر القناة الحمراء. ثم انقر فوق قائمة "الفاصل الزمني". اضبط الفاصل الزمني على 5 دقائق ، والمدة إلى 30 دقيقة ، وقائمة الفاصل الزمني.

حدد أداة "الدائرة" ضمن علامة التبويب "قياس" وارسم دائرة في أي قناة. انقر بزر الماوس الأيمن أثناء تحديد الدائرة واختر "خصائص". ضمن علامة التبويب "الملف الشخصي" ، حدد "كل T" لعرض شدة التألق كدالة للوقت. تأكد من وصول هذا المنحنى إلى هضبة ، مما يشير إلى التوازن ، قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

اخفض محلول المخزن المؤقت إلى أرض متساوية مثل الجهاز لإيقاف التدفق. افصل كل أنبوب مخرج واحدا تلو الآخر وقم بتطبيق 200 ميكرولتر من كل تخفيف للبروتين في قناة المخرج باستخدام ماصة. لا تمارس أي ضغط. دع الجاذبية تقوم بالعمل. افصل الطرف عن الماصة واتركه متصلا بجهاز الموائع الدقيقة. كرر هذه العملية لكل قناة ، وللتأكد من عدم إدخال فقاعات الهواء في القنوات أثناء هذه العملية.

بعد ذلك ، قم بخفض أنبوب المدخل إلى الأرض أسفل جهاز الموائع الدقيقة لبدء تدفق البروتين عبر القنوات الدقيقة. قم بلصق الطرف الحر للأنبوب في حاوية نفايات. قم بتدفق تخفيفات مجال تماثل Pleckstrin لمدة 30 دقيقة. في اللوحة اليسرى من البرنامج ، ضمن علامة التبويب "الفاصل الزمني" ، انقر فوق "ابدأ" لبدء التصوير مرة أخرى.