كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع تشتت الضوء متعدد الزوايا لقلة البروتين

قليل البروتين هو مركب من وحدات فرعية متعددة للبروتين ترتبط ببعضها البعض لتشكيل وحدة وظيفية أكبر.

لتحديد الوزن الجزيئي لمونومرات البروتين وقليل القلة في المحلول بواسطة SEC-MALS ، وهو مزيج من كروماتوغرافيا استبعاد الحجم وتشتت الضوء متعدد الزوايا ، يبدأ بعمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، أو SEC.

يحتوي العمود على حبات هلامية كروية مسامية تشبه المنخل تحبس جزيئات أصغر حجما بداخلها. قم بموازنة العمود بمخزن مؤقت متوافق مع الحالة الأصلية للبروتين.

قم بتحميل عينة تحتوي على مونومرات البروتين والقلات في الجزء العلوي من العمود.

أثناء التدفق ، تمر القلة عبر مساحة الجسيمات الداخلية للعمود ، بينما تصبح المونومرات محاصرة داخل مسام الخرز. يؤدي هذا إلى انتقال أوليغومرات البروتين الأكبر حجما بشكل أسرع من المونومرات الأصغر حجما.

قم بتوجيه أوليغومرات سريعة التصريف ، متبوعة بالمونومرات بطيئة التصفية ، إلى كاشف MALS.

أثناء مرورها عبر الكاشف ، يضيء ضوء الليزر ، والذي ينتشر في زوايا مختلفة. تشتت أوليغومرات متعددة الوحدات الفرعية ضوءا أكثر من المونومر.

تتناسب شدة الضوء المتناثر بزوايا متعددة طرديا مع الوزن الجزيئي لبروتين أوليغومر والمونومر.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد نظام SEC-MALS كما هو موضح في بروتوكول النص. باستخدام كواشف من الدرجة HPLC ، قم بإعداد لتر واحد من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات مع 50 إلى 100 مل من كلوريد الصوديوم. قم بتصفية المخزن المؤقت إلى 0.1 ميكرون باستخدام مرشح سلفون البولي إيثر العلوي أو ما شابه.

قم بتصفية أول 50 إلى 100 مل من المخزن المؤقت في زجاجة النفايات من أجل التخلص من الجسيمات من المرشحات الجافة. بعد ذلك ، قم بتصفية الباقي إلى زجاجة نظيفة ومعقمة تم غسلها مسبقا بالماء المصفى منزوع الأيونات وحفظها لمنع دخول الغبار.

اغسل العمود طوال الليل بمعدل تدفق 0.5 مل في الدقيقة لموازنة العمود في المخزن المؤقت وإزالة الجسيمات. استخدم وضع "التدفق المستمر" الخاص ب FPLC ، وتأكد من عدم توقف التدفق حتى تكتمل جميع عمليات تشغيل SEC-MALS. ضع خلية تدفق dRI في وضع التطهير أثناء التدفق طوال الليل.

عند بدء التدفق ، قم بتكثيف معدل التدفق تدريجيا لمنع تأثير "تساقط العمود" الناجم عن التغير المفاجئ في الضغط في العمود. قم بإيقاف تشغيل الإزالة قبل بدء تشغيل العينة.

تحقق من نظافة النظام عن طريق النقر برفق على الأنبوب في اتجاه مجرى العمود لإطلاق الجسيمات المتراكمة. راقب الإشارة في كاشف 90 درجة على شاشة اللوحة الأمامية لجهاز MALS. تحقق من أن الضوضاء من الذروة إلى الذروة لا تزيد عن 50 إلى 100 ميكروفولت. تحقق أيضا من أن معامل الانكسار أو إشارة RI مستقرة إلى أقل من 1 × ^10-7 وحدات معامل الانكسار.

قم بإجراء حقنة "فارغة" للتحقق من أن الحاقن نظيف من الجسيمات. "الفراغ" هو ببساطة المخزن المؤقت الجاري المحضر في قارورة معقمة جديدة. إذا كانت ذروة الجسيمات لا تزيد عن 1 ملليلتر في الحجم ، ولا تزيد عن 5 مللي فولت فوق خط الأساس ، فهذا يعني أن النظام جاهز للعينات. خلاف ذلك ، قم بإجراء حقن فارغة إضافية حتى يتم تنظيفها أو إجراء الصيانة لتنظيف الحاقن.

الآن ، قم بإعداد ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من BSA بمعدل 1 إلى 2 ملليغرام لكل مليلتر في المخزن المؤقت SEC. قم بتصفية البروتين إلى 0.025 ميكرون باستخدام مرشح طرف المحقنة. تخلص من القطرات القليلة الأولى من المرشح للتخلص من الجسيمات من المرشحات الجافة. بدلا من ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 10,000 مرة جم لمدة 15 دقيقة لتمكين ترسيب الركام غير القابل للذوبان والجزيئات الكبيرة الأخرى. ثم قم بحقن 100 ميكرولتر من محلول BSA في الحلقة.