كالوريمتر المسح التفاضلي لدراسة تفاعل الترابط الحراري للحمض النووي

يساعد كالوريمتر المسح التفاضلي في دراسة تفاعلات الجزيئات الحيوية والترابط عن طريق قياس الحرارة المطلوبة لتشويه طبيعة الجزيء الحيوي في غياب الترابط ووجوده.

للبدء ، خذ مرجعا يحتوي على أبتامير الحمض النووي الحر - قليل النوكليوتيدات أحادية الشريطة - وعينة تحتوي على أبتامير مرتبط بالترابط الحراري. تعمل الروابط على تثبيت الهيكل الثانوي للaptamer.

قم بإجراء مسح أمامي عن طريق تسخين المحاليل. عند الوصول إلى درجة حرارة الانصهار ، تتغير طبيعة الأبتامير الحرة.

تنفصل الأبتامرات المستقرة بالترابط عن الروابط وتتغير طبيعتها عند درجة حرارة أعلى نسبيا ، مما يتسبب في ارتفاع درجة حرارة الانصهار مقارنة بالأبتامير الحرة. في درجات الحرارة المرتفعة ، تحصل مجموعة فرعية من الروابط على شكل ثانوي لا رجعة فيه مع تقارب ربط منخفض.

بعد ذلك ، قم بإجراء فحص عكسي عن طريق تبريد المحاليل لاستعادة بنية أبتامر. عند درجة الحرارة المنخفضة ، ترتبط الروابط الأولية والمحولة في العينة بالأبتامر.

أثناء الفحص الأمامي الثاني ، تنفصل الأبتامرات المرتبطة بتقارب ضعيف مع الروابط المحولة وتتغير طبيعتها عند درجة حرارة أقل من الأبتامرات الأولية المرتبطة بالترابط ، مما يتسبب في انخفاض درجة حرارة الانصهار.

مع عمليات المسح المتتالية ، تستمر الروابط في التحول إلى الشكل الثانوي ، مما يؤدي إلى استنفاد كامل للشكل الأولي. احصل على الترموجرام.

مع كل مسح ، تتحول درجة حرارة انصهار aptamer المرتبط بالترابط نحو aptamer الحر ، مما يشير إلى تقارب الارتباط الضعيف للشكل الثانوي.

قم بتفريغ المحاليل العازلة والجزيئات الحيوية والترابط في مزيل الغاز العلوي للطاولة قبل التحميل في مسعر المسح التفاضلي ، أو DSC. قم بفك مقبض الضغط من DSC. بعد ذلك ، قم بتشغيل أنابيب السيليكون من عازلة العمل ، وقم بتوصيلها بالحافة الأمامية للشعيرات الدموية المرجعية.

قم بإنشاء جسر بين الشعيرات الدموية المرجعية والعينة عن طريق توصيل الحافة المرجعية الخلفية بشفة العينة الأمامية. بعد ذلك ، قم بتوصيل قطعة من أنابيب السيليكون بشفة العينة الخلفية التي تمتد إلى قارورة نفايات مع خط تفريغ متصل. قم بتشغيل خط التفريغ لتنظيف كالوريمتر التفاضلي التفاضلي الضوئي (DSC) بسعة 200 مل من المخزن المؤقت للعمل.

ابدأ بربط أقسام من 3 إلى 5 سم تقريبا من أنابيب السيليكون بالشفاه الشعرية المرجعية. بعد ذلك ، أدخل طرف ماصة سعة 1 مليلتر في أنبوب السيليكون للحافة الخلفية. اسحب 0.8 مل من المخزن المؤقت للعمل باستخدام ماصة، وأدخل طرف الماصة مع المخزن المؤقت في أنبوب السيليكون للحافة المرجعية الأمامية.

اضغط برفق على مكبس الماصة لأسفل لتمرير عازلة العمل عبر أنبوب السيليكون الأمامي إلى الشعيرات الدموية المرجعية وأعلى إلى طرف الماصة المرفق للحافة الخلفية. اضغط على مكبس الماصة لأسفل حتى يصل مستوى عازلة العمل فوق أنبوب السيليكون الأمامي مباشرة. بعد ذلك، حرر مكبس الماصة حتى يصل مستوى عازلة العمل فوق أنبوب السيليكون الخلفي مباشرة. استمر في تمرير المخزن المؤقت للعمل ذهابا وإيابا في الشعيرات الدموية المرجعية لتطهير حجم الفقاعات.

بعد ذلك، قم بتغطية طرف الماصة الخلفية بالسبابة واسحبها برفق لأعلى على طرف الماصة الخلفية والماصة الأمامية لإزالتها من الشفاه المرجعية مع توصيل أنبوب السيليكون. قم بتحميل العينة الشعرية بمخزن مؤقت للعمل كما كان من قبل.

ضع غطاء بلاستيكيا أسود على الحافة المرجعية الخلفية وعواف العينة ، مع ترك الشفاه الأمامية مكشوفة. قم بتوصيل مقبض الضغط ب DSC ثم افتح برنامج DSC واضغط على الجهاز بالنقر فوق السهم الأحمر "لأعلى" في الجزء العلوي من الواجهة بمجرد استقرار قراءة الطاقة. يشار إلى طاقة DSC في مربع في أعلى يمين الواجهة ، جنبا إلى جنب مع درجة حرارة الجهاز وقراءة الضغط.

قم بموازنة DSC مع المخزن المؤقت العامل عن طريق إجراء مسح أمامي وخلفي. في علامة التبويب "الطريقة التجريبية" على الجانب الأيسر من الشاشة ، تأكد من تحديد خيار "المسح" لتشغيل DSC في وضع مسح درجة الحرارة.

في "معلمات درجة الحرارة" ضمن علامة التبويب "الطريقة التجريبية" ، انقر فوق الزر للتدفئة. أدخل 1 و 100 درجة مئوية لدرجات الحرارة التجريبية المنخفضة والعليا ، و 1 درجة مئوية في الدقيقة لمعدل المسح ، و 60 ثانية لفترة التوازن. انقر فوق الزر "إضافة سلسلة" أسفل حقل الإدخال لفترة التوازن. أدخل 2 في حقل "خطوات الإضافة" في النافذة المنبثقة وحدد مربع "التدفئة / التبريد البديل". انقر فوق "موافق".

تظهر عمليات الفحص المضافة في الجزء السفلي من الواجهة. تأكد من أن معلمات كل فحص هي حسب الرغبة. ابدأ التجربة بالنقر فوق الزر الأخضر "تشغيل" في الجزء العلوي من الواجهة. انتقل إلى النافذة المطلوبة وأدخل اسم ملف لحفظ التجربة في النافذة المنبثقة. اعرض تقدم التجربة بالنقر فوق علامة التبويب "البيانات" على يمين علامة التبويب "طريقة التجربة".

قم بتشغيل التجارب المرجعية لطرح خط الأساس لبيانات العينة عن طريق إعادة تحميل DSC بمخزن مؤقت للعمل في كلا الشعيرات الدموية. اجمع العديد من عمليات المسح الأمامي والعكسي على نطاق درجة حرارة مناسب عند 1 درجة مئوية في الدقيقة مع وقت توازن أعلى يبلغ 120 ثانية.

احذف عمليات مسح توازن المخزن المؤقت السابقة من الجزء السفلي من الواجهة عن طريق تمييز كل منها على حدة والنقر فوق "X" الأحمر في منتصف يمين الواجهة.

أضف عمليات المسح الجديدة بالنقر فوق الزر "إضافة سلسلة" ، وإدخال 20 في الحقل ل "خطوات الإضافة" وتحديد مربع "التدفئة / التبريد البديل". ثم انقر فوق "موافق" وقم بتشغيل التجربة بالنقر فوق الزر الأخضر "تشغيل" كما كان من قبل.

كرر هذه الخطوات مع عازلة العمل التي تحتوي على التركيز المطلوب من الترابط في كلا الشعيرات الدموية للحصول على التجارب المرجعية للترابط. اجمع تجربتين منفصلتين لاستخدامهما في الحصول على ثابت المعدل لتحويل الترابط الحراري.

بالنسبة لمجموعة بيانات الجزيئات الحيوية الحرة ، تأكد من أن الشعيرات الدموية المرجعية تحتوي على المخزن المؤقت للعمل ، بينما تحتوي العينة الشعرية على الجزيء الحيوي الحر بالتركيز المطلوب في المخزن المؤقت للعمل. بعد ذلك، قم بتشغيل نماذج التجارب باستخدام نفس إجراء تحميل DSC والمعلمات التجريبية المستخدمة في عمليات المسح المرجعي.

بالنسبة للتجارب المرتبطة بالترابط ، تأكد من أن الترابط في المخزن المؤقت للعمل في الشعيرات الدموية المرجعية وأن الجزيء الحيوي بالإضافة إلى الترابط في المخزن المؤقت للعمل في العينة الشعرية. اغسل النظام بين إضافات الروابط المختلفة كما كان من قبل.

قم بإجراء تجربة إضافية واحدة مع الجزيء الحيوي المرتبط بالترابط الحراري حيث يتم زيادة فترة توازن درجات الحرارة العالية إلى 600 ثانية ، وجميع المعلمات التجريبية الأخرى هي نفسها كما كانت من قبل. انتقل إلى معالجة البيانات وتحليلها كما هو موضح في بروتوكول النص.