JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 3:35 د • July 8th, 2025
لدراسة تفاعلات المستقبلات والترابط ، ابدأ بلوحة متعددة الآبار تحتوي على وسائط مع خلايا مستهدفة تعبر عن روابط الاختبار على سطحها.
أضف خلايا فأر BW هندسيا - مجموعة جديدة من الخلايا البائية تعبر عن مستقبلات خيميرية مرتبطة بالغشاء. تشتمل المستقبلات الخيمرية على مجال خارج الخلية لمستقبل معين مدمج في مجال الإشارات عبر الغشاء وداخل الخلايا لمستقبلات الخلية البائية.
تتفاعل الروابط الموجودة على الخلايا المستهدفة مع المجال خارج الخلية للمستقبلات الخيمرية لخلايا BW ، مما يتسبب في تنشيط مجال الإشارات داخل الخلايا في خلايا BW. يؤدي هذا إلى تشغيل الإشارات النهائية وإنتاج السيتوكينات - جزيئات المراسل الإفرازي التي يتم إطلاقها خارج خلايا BW ، وتظهر في الوسائط.
الطرد المركزي اللوحة. انقل المادة الطافية المحتوية على السيتوكين إلى صفيحة ELISA مغلفة مسبقا بالأجسام المضادة للسيتوكين. تتفاعل السيتوكينات مع مناطق Fab في الأجسام المضادة ، مما يؤدي إلى تجميدها على سطح اللوحة.
عالج اللوحة بمحلول مانع لمنع مواقع الربط غير المحددة. أضف الأجسام المضادة للسيتوكين البيوتينيل ، والتي تتفاعل مع السيتوكينات المرتبطة مسبقا وتشكل مجمعات مناعية.
تراكب اللوحة بمحلول ستربتافيدين مترافق بالإنزيم. يرتبط الستربتافيدين بالبيوتين على المجمعات المناعية.
عالج اللوحة مع الركيزة. ينتج عن تفاعل الإنزيم والركيزة منتجا ملونا ، مما يضفي نفس اللون على المحلول. يؤكد المحلول الملون وجود جزيئات المراسل ، مما يشير إلى تفاعل ناجح بين المستقبل والترابط.
استخدم 50,000 خلية BW منقولة مع أهدافها المرغوبة في بئر واحد من صفيحة 96 بئرا. احتضن الطبق لمدة 48 ساعة. ثم قم بتجميد الطبق عند -20 درجة مئوية.
قم بتغطية لوحة ELISA بجسم مضاد للفأر IL-2. ضع 0.05٪ ميكروغرام من مضاد الماوس IL-2 بحجم 50 ميكرولتر من PBS في كل بئر. احتضان الصفيحة المطلية طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
استخدم فترة حضانة قصيرة عند 37 درجة مئوية لإذابة خلايا BW المجمدة التي تم تحضنها سابقا بأهدافها. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لللوحة ، وانقل 100 ميكرولتر من المادة الطافية من كل بئر إلى لوحة ELISA المطلية مسبقا ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
بعد ذلك ، أضف البيوتين المضاد للماوس IL-2 إلى لوحة ELISA. ثم ، بعد الحضانة والغسيل ، أضف الستربتافيدين المترافق ب HRP إلى الطبق. بعد الحضانة والغسيل ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة TMB إلى كل بئر من لوحة ELISA. أخيرا ، اقرأ لوحة ELISA عند 650 نانومتر.