JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 4:05 د • July 8th, 2025
البروتينات المرتبطة بالنيوكليوتيدات من الجوانين - وهي فئة من GTPases - كمحول جزيئي ، حيث تتنقل بين الشكل النشط المرتبط ب GTP والشكل غير النشط المرتبط بالناتج المحلي الإجمالي.
ترتبط GTPases النشطة بشركاء بروتين محددين. يتنافس هؤلاء الشركاء على نفس موقع الربط على GTPases.
لدراسة الربط التنافسي ، ابدأ بأخذ تعليق GTPase المرتبط ب GTP الذي يثبت جماله على الخرز المغناطيسي. أضف شريك التفاعل الأول - البروتين الموسوم بالفلورسنت أ. احتضن تحت التحريك لإبقاء الخرزات معلقة. يربط البروتين أ ويشبع مواقع الارتباط على جميع جزيئات GTPase.
قسم هذا الحل بالتساوي إلى أنابيب متعددة. أضف شريك تفاعل ثان - بروتين B الموسوم بالفلورسنت - إلى الأنابيب بكميات متزايدة. احتضان تحت التحريض.
يرتبط البروتين B بنفس موقع الارتباط على GTPases - مما يؤدي إلى إزاحة البروتين A بشكل تنافسي.
قم بتعريض الأنابيب لمجال مغناطيسي لجمع الخرز على جانب واحد. تخلص من المادة الطافية لإزالة البروتينات غير المرتبطة. أعد تعليق الخرزات المعقدة بالبروتين في مخزن مؤقت مناسب ، وحدد كمية البروتينات المقلدة.
ارسم الكثافة النسبية للبروتينات A و B المرتبطة ب GTPase عند كل تركيز من البروتين B.
يصل البروتين B إلى حالة توازن - يحتل مواقع الارتباط لنصف جزيئات GTPase - بتركيز أقل نسبيا من البروتين A ، مما يشير إلى التقارب الأكبر للبروتين B ل GTPase.
لإجراء ربط المنافسة ، قم بإعداد ستة أنابيب ميكروفوجي يحتوي كل منها على 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط للمنافسة. يجب أن يحتوي كل أنبوب أيضا على 10 ميكرولترات من حبات Rac1 المحملة بالنيوكليوتيدات وخمسة ميكرولترات من البروتين المرتبط ب Rac1 A كبروتين ملزم ثابت.
أضف إلى كل أنبوب 0 أو 1 أو 2.5 أو 5 أو 10 أو 20 ميكرولترا من البروتين B المرتبط ب Rac1 كبروتين ربط متغير. تفترض هذه الأحجام تركيزات مخزون متساوية تقريبا لبروتينات الربط الثابتة والمتغيرة وقد تحتاج إلى تعديل.
اصنع الحجم الإجمالي لخليط الربط إلى 235 ميكرولتر عن طريق إضافة المخزن المؤقت الملزم. بعد ذلك ، قم بإعداد أنبوب ميكرو فوج يحتوي على 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمنافسة ، و 10 ميكرولترات من حبات Rac1 التجريبية المحملة بالنيوكليوتيدات ، و 10 ميكرولترات من البروتين A المرتبط ب Rac1.
بعد ذلك ، قم بإعداد الناتج المحلي الإجمالي و GTPγS وعدم وجود أنابيب تحكم في النيوكليوتيدات كما هو موضح في بروتوكول النص. احتضان الأنابيب لمدة ساعتين ، وخلطها عن طريق الانعكاس عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت الملزم.
أخيرا ، قم بإزالة البروتينات المرتبطة في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة.