الفحص المجهري TIRF لتصور ديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة

تتبلمر مونومرات الأكتين بطريقة من الرأس إلى الذيل لتشكيل ألياف رقيقة تسمى الخيوط الدقيقة. وبالمثل ، تتبلمر ثنائيات التوبولين إلى أنابيب دقيقة أسطوانية مجوفة أطول. تحافظ مكونات الهيكل الخلوي هذه على شكل الخلية وتسهل الحركة الخلوية.

لتصور ديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة عن طريق الفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي ، TIRF ، خذ مجموعة تصوير مخصصة.

تتكون مجموعة التصوير من غطاءين: غطاء علوي مطلي بالسيلان m-PEG وغطاء سفلي مطلي بالسيلان البيوتين-PEG. يتم تباعد الغطاءين طوليا بشريط لاصق على الوجهين ومختومان من كلا الطرفين لإنشاء قناة تدفق.

الماصة BSA في قناة التدفق لتجهيز الغرفة. أضف محلول الستربتافيدين واحتضانه. ترتبط جزيئات الستربتافيدين بجزيئات البيوتين المتصلة ب PEG-silane الخاص بالغطاء السفلي.

تدفق المخزن المؤقت TIRF إلى القناة. أضف محلول مزيج الهيكل الخلوي الذي يحتوي على ثنائيات توبولين غير مصنفة وخضراء تحمل علامة الفلوروفور ، جنبا إلى جنب مع مونومرات الأكتين غير المسمى والمسمى بالبيوتين والأرجواني الموسوم بالفلوروفور.

بعد ذلك ، أضف محلول تفاعل يحتوي على ATP - عامل تعزيز بلمرة الأكتين ، و GTP - عامل تعزيز بلمرة التوبولين ، وبروتين اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة. حضن.

ترتبط ثنائيات التوبولين بجزيئات GTP وتبلمر ، بينما ترتبط مونومرات الأكتين بجزيئات ATP وتبلمر لتكوين أنابيب دقيقة وخيوط دقيقة ، على التوالي.

ضع مجموعة التصوير تحت مجهر TIRF. إثارة الفلوروفورات بالليزر ذي الأطوال الموجية المناسبة.

ينعكس ضوء الإثارة داخليا ، ويخلق مجالا ضوئيا يضيء بشكل انتقائي الفلوروفورات في منطقة محدودة بالقرب من واجهة الزجاج والماء ، حيث يوجد وسيلتان بمعامل انكسار مختلفة. في هذه المنطقة ، تظهر الخيوط الدقيقة باللون الأرجواني ، وتظهر الأنابيب الدقيقة باللون الأخضر.

قطع 12 شريطا من الشريط المزدوج الظهر على الوجهين بطول 24 ملم. قم بإزالة جانب واحد من دعامة الشريط ، وقم بتثبيت قطع الشريط المجاورة للأخاديد الستة الموجودة في غرفة تصوير نظيفة. قم بإزالة القطعة الثانية من دعامة الشريط ، لكشف الجانب اللاصق من الشريط على طول كل أخدود غرفة ، وضع الغرفة ، بحيث يكون جانب الشريط لأعلى ، على سطح نظيف.

امزج راتنجات الايبوكسي ومحاليل المقسى ، واحدا لواحد في قارب وزن صغير ، واستخدم طرف P1000 لوضع قطرة من الإيبوكسي المختلط بين شرائط الشريط في نهاية كل أخدود غرفة تصوير. ثم ضع شريط الغرفة ، أو جانب الإيبوكسي لأعلى ، على سطح نظيف.

قم بإزالة الغطاء المطلي من حاضنة 70 درجة مئوية ، واشطف الأسطح المطلية وغير المطلية للأغطية بالماء المقطر المزدوج ست مرات. يجف بغاز النيتروجين المصفى ، ثم يلصق على غرفة التصوير ، مع جانب طلاء الغطاء باتجاه الشريط.

استخدم طرف ماصة P200 أو P1000 للضغط على واجهة الشريط الزجاجي، لضمان إحكام جيد بين الشريط وغطاء الغطاء. احتضان الغرف المجمعة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق على الأقل ، للسماح للإيبوكسي بإغلاق جدران الغرفة بالكامل قبل الاستخدام.

صلاحية غرف التروية في غضون 12 إلى 18 ساعة من التجميع. استخدم مضخة التروية ، وقم بتبادل محاليل التكييف بالتتابع في غرفة التروية عن طريق تدفق 50 ميكرولترا من 1٪ BSA لتجهيز غرفة التصوير.

قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من خزان تركيب قفل Luer. ثم قم بتدفق 50 ميكرولتر من 0.005 ملليغرام لكل مليلتر من الستربتافيدين ، واحتضانه لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من الخزان.

قم بتدفق 50 ميكرولترا من 1٪ BSA لمنع الارتباط غير المحدد ، واحتضانه لمدة 10 إلى 30 ثانية. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من الخزان. بعد ذلك ، قم بتدفق 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت الدافئ 1x TIRF ، ثم 50 ميكرولترا من بذور الأنابيب الدقيقة المستقرة و 50٪ من البذور المصنوعة من الأنابيب الدقيقة الحيوية ، المخففة في 1x TIRF buffer.

اضبط المسرح أو جهاز السخان الموضوعي للحفاظ على درجة حرارة 35 إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، قبل تصوير أول تفاعل كيميائي حيوي. بعد ذلك، اضبط الفاصل الزمني للاكتساب على كل خمس ثوان، لمدة 15 إلى 20 دقيقة. بعد ذلك ، اضبط التعرض بالليزر 488 و 647 على 50 إلى 100 مللي ثانية بقوة 5٪ إلى 10٪ ، عن طريق ضبط تفاعل البلمرة أولا لبدء تجميع خيوط الأكتين.

احصل على الصور عند 647 نانومتر ، وقم بإجراء التعديلات المناسبة. بعد ذلك ، اضبط تفاعل البلمرة في بئر نضح مشروط ثان ، لبدء تجميع الأنابيب الدقيقة. تصور عند 488 نانومتر ، وقم بإجراء التعديلات المناسبة.

اجمع بين ثلاثة ميكرولترات من 10 ميكرومولار 488 توبولين مع 7.2 ميكرولتر من 100 ميكرومولار توبولين غير مصنف ، لا يزيد عن 15 دقيقة قبل الاستخدام. بعد ذلك ، امزج ثلاثة ميكرولترات من الأكتين البيوتينيل المخفف بكميات مناسبة من الأكتين غير المسمى والفلوري ، بحيث يكون المزيج النهائي 12.5 ميكرومولار من الأكتين الكلي ، مع 10٪ إلى 30٪ ملصق الفلورسنت.

قم بإعداد مزيج الهيكل الخلوي عن طريق الجمع بين ميكرولترين من مخزون مزيج الأكتين 12.5 ميكرومولار مع مزيج مخزون التوبولين ، قبل 15 دقيقة على الأكثر من التصوير. يحفظ على الثلج حتى الاستخدام.

قم بإعداد مزيج تفاعل البروتين من خلال الجمع بين جميع المكونات والبروتينات التجريبية الأخرى ، بما في ذلك 2x TIRF buffer ، ومضاد للتبييض ، والنيوكليوتيدات ، والمخازن المؤقتة ، والبروتينات الملحقة. احتضان مزيج الهيكل الخلوي في مزيج تفاعل البروتين بشكل منفصل ، عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 ثانية.

لبدء التفاعل ، أضف محتويات مزيج تفاعل البروتين إلى مزيج الهيكل الخلوي ، واخلطه. تدفق 50 ميكرولترا من مزيج التفاعل الذي يحتوي على 1x عازلة TIRF مكملة ب 15 توبولين خال من الميكرومولار ، وواحد مليمولار GTP ، و 0.5 ميكرومولار مونومرات أكتين ، وأحجام مناسبة من أدوات التحكم في العازلة إلى غرفة التروية.

قم بتسجيل فيلم بفاصل زمني باستخدام برنامج المجهر ، للحصول عليه كل خمس ثوان ، لمدة 15 إلى 20 دقيقة. قم بتكييف بئر نضح جديد ، واستبدل حجم المخزن المؤقت بالبروتين التنظيمي ذي الأهمية وعناصر التحكم في العازلة. الحصول على لتقييم البروتينات التنظيمية لوظائف الأنابيب الدقيقة الأكتين الناشئة.