الفحص المجهري للورقة الضوئية الشبكية لتصور تفاعلات المستقبلات والترابط في الخلايا الحية

الفحص المجهري للصفائح الضوئية الشبكية ، LLSM ، تصور تفاعلات مستقبلات سطح الخلية والترابط في الخلايا الحية ذات الدقة الزمانية المكانية العالية.

خذ غطاء يحتوي على خلايا معبرة عن الترابط المنقولة تنبعث منها مضان أحمر. قم بتوصيل خلية الغطاء بحيث يكون الجانب لأعلى على حامل عينة مدهون بالزبدة. قم بتثبيت الحامل على بيزو مرحلة المجهر للسماح بوضع العينة بدقة والمسح الضوئي أثناء التصوير. اضبط إعدادات البرنامج للتركيز على خلية واحدة تعبر عن الترابط.

ماصة تعليق الخلية الشفطرة عن المستقبلات على الغطاء. يتم تمييز المستقبلات بأجسام مضادة تحمل علامة الفلوروفور الأخضر. تصور أزواج الخلايا المتفاعلة.

ينبعث ليزر الإثارة في المجهر شعاع ليزر دائري مستقطب خطيا يمر عبر عدسات أسطوانية لإنشاء ورقة ضوئية. يتم إسقاط ورقة الضوء على معدل يزيل الحيود الزائد ويحوله إلى نمط شبكي رفيع للغاية.

تضيء الورقة الضوئية الشبكية قسما رفيعا للغاية من زوج الخلايا المتفاعلة ، ويتم التقاط التألق المنبعث من الخلايا المتفاعلة بشكل عمودي على الحزمة الساقطة. قم بتصوير زوج الخلايا المتفاعلة في طائرات Z متعددة ، والتقط صورا ثنائية الأبعاد في كل مستوى بؤري باستخدام كاميرا عالية السرعة.

باستخدام برنامج مناسب ، اجمع بين هذه الصور لتشكيل مكدس z - صورة عالية الدقة رباعية الأبعاد توضح الديناميكيات الزمانية المكانية للتفاعل بين مستقبلات سطح الخلية والرابط.

أضف 10 مل من الماء و 30 ميكرولتر من الفلورسين إلى حمام LLSM. أولا ، اضغط على Image (Home) لنقل الكائن إلى موضع الصورة ، وانظر إلى نمط شعاع ليزر وعاء واحد.

قم بمحاذاة شعاع الليزر باستخدام الدليل والمنطقة المحددة مسبقا ذات الاهتمام لجعل الشعاع نمطا رقيقا متوازنا في جميع الاتجاهات. يجب أن يظهر الشعاع أيضا مركزا في كاميرا الباحث. استخدم ضابطي ضبط إمالة المرآة وميكرومتر التركيز البؤري العلوي واللون الموضوعي لضبط الحزمة.

بعد ذلك ، اغسل الحمام والأهداف بما لا يقل عن 200 مل من الماء لإزالة أي فلورسين تماما.

لتصوير حبات الفلورسنت القياسية، قم بتشغيل Dither عن طريق الإعداد على 3 في مربع "X Galvo Range"، واضغط على Live لعرض الحقل الحالي. اضبط مرآة الإمالة واللون الموضوعي وميكرومتر التركيز البؤري يدويا للحصول على أعلى قيم الرمادية. بعد ذلك ، اضبط حسب الضرورة للحصول على الأنماط المناسبة للمسح الموضوعي ، و Z galvo ، و Z plus objective ، وأوضاع التقاط المسح الضوئي العينة. بعد ذلك ، اضغط على تنفيذ في وضع مسح العينة لتجميع وظيفة انتشار نقطة العينة لإزالة الانحراف وإلغاء الالتواء. قم بتغيير الليزر إلى وضع ثلاثي الألوان، واضغط على تنفيذ مرة أخرى.

للبدء ، أضف 100,000 خلية مقدمة للمستضد إلى الغطاء الدائري المحضر بقطر 5 ملم ، واتركها تستقر لمدة 10 دقائق. دهن حامل العينة وأضف الغطاء إليه جانب الخلية لأعلى.

بعد ذلك ، أضف قطرة من وسائط التصوير إلى الجزء الخلفي من قسيمة الغطاء. قم بربط حامل العينة على البيزو، واضغط على الصورة (الصفحة الرئيسية). ابحث عن خلية تقدم مستضد لتصويرها وتأكد من أن LLSM وبرنامج التصوير يعملان بشكل صحيح.

اضغط على Live لعرض الصورة الحالية. تحرك على طول Z للعثور على الغطاء والخلايا. ابحث عن مركز الخلية العارضة للمستضد عن طريق التحرك في الاتجاه Z ، ثم اضغط على إيقاف لإيقاف الليزر مؤقتا. تحقق من 3D وأدخل الإعدادات المطلوبة. اضغط على Enter ثم اضغط على تنفيذ لتجميع البيانات.

اخفض المسرح إلى وضع التحميل ، وأضف 50 ميكرولترا من الخلايا التائية في وسائط التصوير ، مباشرة فوق الغطاء. من الأفضل ترك قطرة تتشكل في نهاية طرف الماصة ثم لمس الطرف بسائل الحمام. ارفع المسرح للخلف بالنقر فوق صورة (عودة).

ابدأ التصوير. تأكد من تعيين مكدس Z المطلوب وطول الفاصل الزمني. على سبيل المثال، قم بتصوير 60 مكدسات Z بحجم خطوة 0.4 ميكرومتر وإدخال إطارات الوقت 500. توقف عن التسجيل قبل الوصول إلى 500 إطار لتجنب التبييض الضوئي. استخدم الوضع المباشر للبحث عن أزواج الخلايا، وعندما تكون جاهزة وإدخال الإعدادات المطلوبة، اضغط على تنفيذ لتجميع البيانات.