الفحص المجهري لانعكاس التداخل للتصور الخالي من الملصقات لديناميكيات الأنابيب الدقيقة

يتيح الفحص المجهري لانعكاس التداخل تصوير الأنابيب الدقيقة التي تنمو وتتقلص ديناميكيا.

ثبت شرائح البارافين على غطاء واحد وضع غطاء أصغر قليلا في الأعلى. يسخن لإذابة البارافين ، وتشكيل قناة مغلقة. الماصة محلول يحتوي على أجسام مضادة عبر القناة. تلتصق الأجسام المضادة بسطح الغطاء. أضف محلولا مانعا ، مما يمنع المناطق غير المرتبطة بالأجسام المضادة ويمنع ارتباط البروتين غير المحدد.

ضع الغطاء على مرحلة المجهر. اضبط سخان العينة على درجة حرارة تسهل نمو الأنابيب الدقيقة.

استقرت بذور الأنابيب الدقيقة للماصة باستخدام غوانوزين ثلاثي الفوسفات غير القابل للتحلل المائي ، GTP ، التناظرية. ترتبط البذور بالغطاء المطلي بالأجسام المضادة. أضف مخزن مؤقت يحتوي على توبولين غير مسمى و GTP وعوامل الاختزال.

في درجة الحرارة المثلى والظروف العازلة ، تعمل البذور كمواقع تنوي ، مما يسمح بربط الأنابيب غير المسمى ونمو الأنابيب الدقيقة.

ابدأ التصوير. يركز الضوء الساقط من خلال غشاء فتحة على مقسم شعاع يعكس الضوء جزئيا إلى الهدف ، ويضيء العينة. تعكس واجهة الغطاء الزجاجي المخزن المؤقت جزئيا الضوء الساقط. يمر الضوء الساقط المتبقي وينعكس في واجهات الأنابيب الدقيقة العازلة.

بناء على مسافة غطاء الأنابيب الدقيقة ، تتداخل الحزم المنعكسة من الواجهتين ، مما ينتج عنه تداخل بناء - تتحد الحزم لإنتاج إشارة ساطعة ، أو تداخل مدمر - تلغي الحزم لإنتاج إشارة مظلمة.

تصور الأنابيب الدقيقة كصور عالية التباين. التقط صورا بفاصل زمني ، واكتشف نمو الأنابيب الدقيقة وانكماشها.

للبدء ، أدخل مرآة 50/50 في عجلة المرشح لمجهر الفلورسنت باستخدام مكعب مرشح مناسب. تعامل مع المرآة بحذر لأنها غالبا ما تحتوي على طلاء مضاد للانعكاس. انتقل إلى هدف تكبير عالي له أيضا فتحة عددية عالية. الهدف الموضح هنا هو هدف زيت 100x بفتحة عددية تبلغ 1.3.

بعد ذلك ، استخدم شفرة حلاقة وشريحة مجهر كحافة مستقيمة لقطع شرائط بعرض 3 ملليمترات من فيلم البارافين البلاستيكي. ضع اثنين من شرائط فيلم البارافين البلاستيكية على بعد 3 ملليمترات على غطاء نظيف مقاس 22 × 22 ملم. بعد ذلك ، ضع غطاء مقاس 18 × 18 ملم أعلى الشرائط لتشكيل قناة.

انقل الغطاء إلى كتلة حرارية عند 100 درجة مئوية لمدة 10 إلى 30 ثانية حتى يشكل فيلم البارافين قناة مغلقة. باستخدام ماصة ، قم بالتدفق في 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الجسم المضاد المضاد للرودامين عن طريق التروية ، واحتضان الشريحة لمدة 10 دقائق.

بعد الحضانة ، اغسل القناة خمس مرات باستخدام BRB80 المصفى. بعد ذلك ، قم بالتدفق في 1٪ بولوكسامير 407 في BRB80 المصفى لمنع السطح من الارتباط غير المحدد ، واحتضان الشريحة لمدة 10 دقائق. مرة أخرى ، اغسل القناة خمس مرات باستخدام BRB80 المصفى.

لمنع العينة من الجفاف ، أضف قطرتين من BRB80 المصفى في نهايات القناة وأضف المزيد من المخزن المؤقت حسب الحاجة. ضع العينة على مرحلة المجهر وقم بتشغيل مصدر ضوء إضاءة epi. ركز على حافة فيلم البارافين للعثور على سطح العينة ، ثم حرك الحقل لضبط العرض على مركز الغرفة. ستلاحظ أسطحا متعددة حيث يتم تحريك الهدف لأعلى ولأسفل بسبب الانعكاس الخلفي للضوء من البصريات داخل المسار البصري.

بعد ذلك ، قم بتوسيط الحجاب الحاجز الميداني في مجال الرؤية عن طريق إغلاقه حتى المنتصف واستخدام مسامير الضبط بمجرد محاذاة الحجاب الحاجز بشكل صحيح ، أعد فتحه. بعد ذلك ، قم بالتمرير في عدسة برتراند لعرض المستوى البؤري الخلفي ، المعروف أيضا باسم تلميذ الخروج من الهدف.

أغلق غشاء فتحة العدسة خارج حواف تلميذ الخروج، واستخدم براغي الضبط لتوسيط غشاء فتحة العدسة فيما يتعلق بتلميذ الخروج. تحقق جيدا عن طريق فتح غشاء فتحة العدسة ومطابقة حوافه مع حواف تلميذ الخروج. بعد ذلك ، اضبط غشاء الفتحة على حوالي 2/3 من الفتحة العددية للهدف.

لتصوير ديناميكيات الأنابيب الدقيقة باستخدام الأنابيب الدماغية ، ابدأ بضبط درجة حرارة سخان العينة على 37 درجة مئوية. باستخدام ماصة ، قم بتدفق 10 ميكرولترات من بذور الأنابيب الدقيقة المثبتة ب GMPCPP ، وراقبها وهي مرتبطة بالسطح عن طريق تصوير السطح على الهواء مباشرة. بمجرد ربط 10 إلى 20 بذرة في مجال الرؤية ، اغسل العينة باستخدام ضعف حجم قناة BRB80 المسخن والمفلتر.

بعد ذلك ، تدفق في 10 ميكرولتر من مزيج البلمرة.

لقياس نمو الأنابيب الدقيقة ، قم بإعداد فاصل زمني باستخدام برنامج الاستحواذ للحصول على صورة كل 5 ثوان لمدة 15 دقيقة. عزز التباين من خلال الحصول على صورة متوسطة تبلغ 10 في كل نقطة زمنية. الحصول على صور الخلفية كما هو موضح في القسم السابق. احسب الوسيط بالانتقال إلى الصورة ، وتحديد المكدس ، ثم Z Project ، ثم الوسيط. اطرح الخلفية المقابلة بالانتقال إلى معالجة ، والانتقال إلى حاسبة الصورة ، واختيار طرح من القائمة المنسدلة. تأكد من تحديد خيار نتيجة التعويم 32 بت.

بالنسبة لانكماش الأنابيب الدقيقة ، احصل على صور بمعدل 100 إطار في الثانية عن طريق ضبط التأخير الزمني على الصفر والحفاظ على وقت التعريض عند 10 مللي ثانية.