الفحص المجهري للقوة الذرية الساكنة لتصور وتوصيف النيوكليوسومات المجمعة

تتكون النيوكليوسومات ، الوحدة المتكررة الأساسية للكروماتين حقيقيات النواة ، من لفات الحمض النووي ملفوفة حول نواة من بروتينات الهيستون.

لتصور النيوكليوسومات المجمعة عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية الساكنة ، AFM ، ابدأ بشريط ميكا رفيع ، يعمل لجعل السطح موجبة الشحنة. قطع الشريط إلى مربعات صغيرة. ماصة تعليق النيوكليوسوم المجمع.

يرتبط الحمض النووي سالب الشحنة في النيوكليوسوم بالمجموعة الموجبة الشحنة لشريط الميكا الوظيفي من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية. يغسل بمحلول عازل لمنع اكتظاظ النيوكليوزوم.

قم بتثبيت شريط الميكا على قرص دعم العينة. قم بتثبيته على مرحلة أداة AFM.

قم بتوصيل حامل المسبار بالرأس البصري للأداة. يحتوي الحامل على ناتئ AFM مثبت مسبقا مع طرف في قمته.

قم بمحاذاة شعاع الليزر على ظهر الكابولي لقياس الانحراف بدقة. ضع الطرف على اتصال مباشر بالسطح المحتوي على النيوكليوزوم.

أثناء تصوير وضع التلامس ، عندما يمسح طرف الكابولي سطح النيوكليوسوم ، تنشأ قوى التنافر بعد التفاعلات بين ذرات الطرف والعينة. هذا يتسبب في ثني الكابولي. ينعكس شعاع الليزر بشكل مختلف ويتم توجيهه إلى كاشف الضوء الحساس للموضع.

تحافظ حلقة التغذية الراجعة على انحراف ناتئ ثابت عن طريق حركة الماسح الضوئي الرأسية أثناء الفحص. تستخدم إشارة التغذية الراجعة هذه أيضا لتوليد صور النيوكليوسوم الطبوغرافي. يظهر قلب النيوكليوسوم على شكل نقط ساطعة ، بأذرع رفيعة تمثل الحمض النووي المحيط بها.

جهز سطح الميكا للتصوير الثابت AFM. للقيام بذلك ، قم أولا بإعداد محلول مخزون APS 50 مليمول في الماء منزوع الأيونات. قم بتخزين 1 ملليلتر من المحلول عند 4 درجات مئوية ، حتى تكون هناك حاجة إليها.

من محلول المخزون ، قم بإعداد محلول APS يعمل لتعديل الميكا عن طريق إذابة 50 ميكرولترا من مخزون APS سعة 50 مليمولار في 15 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات. امزج المحلول ثم املأ الكوفيت بالمحلول.

بعد ذلك ، قم بقص شرائح 1 × 3 سم من الميكا من صفائح الميكا عالية الجودة. تأكد من أن القطعة مناسبة عند وضعها قطريا في كوفيت. بعد ذلك ، شقي طبقات الميكا حتى يتشقق كلا الجانبين حديثا وتصبح القطعة رقيقة مثل 0.1 ملليمتر.

ضعي قطعة الميكا على الفور في الكوفيت المملوء ب APS ، واحتضنني الميكا لمدة 30 دقيقة. انقلي قطعة الميكا إلى كوفيت مملوء بالماء المقطر منزوع الأيونات وانقعيها لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، استخدم الأرجون لتجفيف جانبي شريط APS-mica تماما.

ضع شريطا لاصقا مزدوج الوجه على عدة كرات الصولجان المغناطيسية ، وضعها على الجانب. بعد ذلك ، قم بقص الركيزة APS-mica إلى مربعات بحجم 1 سم × 1 سم وقم بتغطيتها بطبق بتري نظيف. بعد ذلك ، قم بإعداد ثلاثة تخفيفات من النيوكليوسومات المجمعة باستخدام مخزن مؤقت مفلتر 0.22 ميكرون يحتوي على 10 ملليمولار من HEPES و 4 ملليمولار كلوريد المغنيسيوم عند درجة حموضة 7.5.

للحد من فقدان النيوكليوسومات عند التركيز النهائي المنخفض ، يجب أن يتم التخفيف واحدا تلو الآخر ، مباشرة قبل الترسيب على APS-mica.

ضع من 5 إلى 10 ميكرولترات من كل عينة نيوكليوسوم في وسط قطعة APS-mica ، واتركها تحتضن لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، اشطف العينة برفق ب 2 إلى 3 ملليلتر من الماء المقطر منزوع الأيونات لإزالة المكونات العازلة ، وجفف العينة المترسبة تحت تدفق خفيف من الأرجون.

للبدء ، قم بتركيب طرف على حامل الطرف لإعداد AFM. بعد ذلك ، قم بتركيب العينة الأولى على مرحلة AFM ، مع الحرص على عدم ملامسة سطح العينة. ضع الليزر فوق الكابولي حتى يصل مجموعه إلى الحد الأقصى واضبط قيم الانحراف الرأسي والجانبي على ما يقرب من 0. بعد ذلك ، قم بضبط مسبار AFM للعثور على تردد الرنين الخاص به. اضبط سعة محرك الأقراص ، واضبط حجم الصورة على 100 × 100 نانومتر. بمجرد الإعداد ، انقر فوق الزر "إشراك" لبدء النهج.

عند اكتمال النهج ، قم بتحسين نقطة ضبط السعة تدريجيا حتى يظهر سطح العينة بوضوح. بعد ذلك ، قم بزيادة حجم المسح الضوئي إلى 1 ميكرون في 1 ميكرون والدقة إلى 512 × 512 بكسل. أخيرا ، انقر فوق الالتقاط زر لبدء الحصول على الصور.