الفحص المجهري للقوة الذرية بفاصل زمني عالي السرعة لالتقاط ديناميكيات النيوكليوسوم

تتكون النيوكليوسومات - وحدات تكرار الحمض النووي حقيقية النواة - من أجزاء من الحمض النووي ملفوفة حول نوى بروتين هيستون. يعد فك الحمض النووي حول قلب هيستون أمرا بالغ الأهمية لديناميكيات النيوكليوسوم.

لالتقاط ديناميكيات النيوكليوسوم ، ابدأ بركيزة الميكا السلسة والوظيفية المثبتة على مجهر القوة الذرية ، AFM ، مرحلة الماسح الضوئي. تراكب الركيزة بمخزن مؤقت يحتوي على النيوكليوزوم.

يتفاعل الحمض النووي النيوكليوسوم سالب الشحنة مع الشحنات الموجبة على الميكا الوظيفية ، مما يؤدي إلى جمالها على السطح. اغسل ركيزة الميكا المجمدة بمحلول عازل لمنع اكتظاظ النيوكليوسومات.

انقل مرحلة الماسح الضوئي المحتوي على النيوكليوسوم إلى غرفة تصوير تحتوي على ناتئ مركب مسبقا ، مع طرف على الحافة ويواجه لأعلى نحو النيوكليوسومات.

املأ الغرفة بمخزن مؤقت للتصوير. قم بمحاذاة شعاع الليزر على الجزء الخلفي من الكابول لضمان قياسات الانحراف الدقيقة.

يتأرجح طرف AFM بالقرب من النيوكليوسومات الملفوفة بالكامل ويقوم بالمسح فوق السطح لقياس ارتفاع النيوكليوسومات على فترات منتظمة.

فك الحمض النووي التلقائي من ارتفاع النيوكليوسوم ، مما يؤدي بالتناوب بين تذبذبات الطرف ويؤدي إلى انحراف ناتئ. يؤدي هذا الانحراف الكابولي إلى تغيير موضع شعاع الليزر المنعكس ، والذي يتم اكتشافه بواسطة كاشف حساس للموضع وينتج صورا للنوكليوسوم الطبوغرافية.

في صور AFM ، يظهر قلب الهيستون على شكل نقطة متوهجة مع حمض نووي غير مغلف بارتفاعات متزايدة بمرور الوقت ، مما يدل على ديناميكيات النيوكليوسوم.

استخدم غراء الماسح الضوئي للقضيب الزجاجي لتوصيل قضيب زجاجي بمرحلة الماسح الضوئي AFM. اتركه يجف لمدة 10 دقائق على الأقل. في غضون ذلك ، اصنع قطعا دائرية بسمك 0.1 ملم من الميكا بقطر 1.5 ملم عن طريق تثقيبها من ورقة ميكا أكبر. استخدم غراء قضيب الميكا الزجاجي عالي السرعة AFM لربط قطعة الميكا هذه بالقضيب الزجاجي على AFM عالي السرعة ، واتركها على حالها لمدة 10 دقائق على الأقل أثناء تجفيفها.

بعد ذلك ، قم بقطع الطبقات من الميكا باستخدام شريط حساس للضغط حتى تظهر طبقة مشقوقة جيدا على الشريط. بعد ذلك ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من مخزون APS سعة 50 مليمولار في 99 ميكرولتر من الماء المقطر منزوع الأيونات لصنع محلول APS بحجم 500 ميكرومولار. ضع 2.5 ميكرولتر من المحلول على سطح الميكا المشقوق حديثا ، واترك السطح يعمل لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، اشطف الميكا عدة مرات بالماء المقطر منزوع الأيونات عن طريق شطف 3 ميكرولتر. قم بإزالة الماء تماما بعد كل شطف عن طريق وضع منديل غير منسوج على حافة الميكا. بعد الشطف النهائي ، ضع 3 ميكرولترات من الماء المقطر منزوع الأيونات على السطح ، واتركه لمدة 5 دقائق على الأقل لإزالة أي APS غير مرتبط على وجه التحديد.

بعد ذلك ، ضع المسبار في حامل AFM عالي السرعة ، وضع الحامل على مرحلة AFM بحيث يكون الطرف متجها لأعلى. اشطف الحامل باستخدام 100 ميكرولتر من الماء المقطر منزوع الأيونات ، متبوعا بشطفتين سعة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتصوير النيوكليوسوم المفلتر بحجم 0.22 ميكرون. بعد الانتهاء من الشطف ، املأ الغرفة ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتصوير النيوكليوسوم ، وغمر الحافة.

اضبط موضع الكابولي حتى يتم ضربه بالليزر. بعد ذلك ، اشطف APS-mica خمس مرات باستخدام مخزن مؤقت لتصوير النيوكليوسوم المصفى ، باستخدام 4 ميكرولتر لكل شطف. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من مخزون تجميع النيوكليوسوم إلى 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتصوير النيوكليوسوم المصفى للحصول على تركيز نهائي للنيوكليوسوم يبلغ 1 نانو ضرس.

ضع 2.5 ميكرولتر من هذا التخفيف على السطح ، واتركه لمدة دقيقتين. اشطف السطح مرتين ب 4 ميكرولترات من محلول تصوير النيوكليوسوم لتجنب الاكتظاظ. بعد الشطف النهائي ، اترك السطح مغطى بمخزن مؤقت للتصوير. اضبط الماسحة الضوئية والعينة أعلى حامل الطرف بحيث تكون العينة مقلوبة لأسفل.

لبدء النهج ، استخدم وظيفة الاقتراب التلقائي بسعة نقطة ضبط قريبة من سعة التذبذب الحر. اضبط نقطة الضبط حتى يتم تتبع السطح جيدا. بعد ذلك ، اضبط مساحة الصورة حوالي 150 × 150 نانومتر إلى 200 × 200 نانومتر بمعدل الحصول على البيانات يبلغ حوالي 300 مللي ثانية لكل إطار تصوير.