القياس الكمي لتكوين الكشكشة الغشائية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح

تعمل المحفزات الخارجية على تنشيط الخلايا وتحفز نتوء الغشاء الدائري ثلاثي الأبعاد ، أو تكوين كشكشة الغشاء ، وهو أمر ضروري للأنشطة الخلوية المختلفة.

لتصور تكوين كشكشة الغشاء ، ابدأ بلوحة متعددة الآبار تحتوي على غطاء في القاعدة. يحتوي الجزء العلوي من الغطاء على ضامة مستزرعة.

عالج هذه البلاعم بجزيئات المحفزة التي تنشط الخلايا ، مما يسهل إعادة تنظيم الهيكل الخلوي وتكوين نتوء الغشاء. تراكب الخلايا بمحلول مثبت ، وربط البروتينات ، والحفاظ على البنية الخلوية.

عالج الضامة الثابتة بتركيزات متزايدة من الكحول للجفاف الكامل. جفف هذه البلاعم باستخدام مجفف نقطة حرجة ، والقضاء على أي آثار للماء لتحسين التصوير.

قم بتركيب الغطاء على حامل عينة مجهر إلكتروني ماسح ، أو SEM ، باستخدام شريط موصل. قم بتغطية الغطاء المحتوي على البلاعم بطبقة معدنية رقيقة ، مما يضمن الموصلية الإلكترونية الجيدة أثناء التصوير.

ضع الغطاء في غرفة SEM. ركز شعاع الإلكترون على الغطاء. يصطدم شعاع الإلكترون بغشاء البلاعم المطلي بالمعدن ، مما يتسبب في توليد إلكترون ثانوي منخفض الطاقة من سطح الغشاء.

تعمل النتوءات ثلاثية الأبعاد على تشتيت الإلكترونات بشكل مختلف عن بقية الغشاء ، مما يبرز هذه الميزات على سطح الخلية. يجمع الكاشف الإلكترونات المتناثرة من مناطق سطح الخلية المختلفة ، مما يولد صورة تباين.

في صورة SEM ، تظهر البلاعم أغمق مع نتوءات دائرية ساطعة على السطح ، مما يؤكد تكوين الكشكشة.

ابدأ بوضع أغطية زجاجية معقمة في آبار صفيحة 24 بئرا باستخدام ملقط معقم. بعد ذلك ، قم بزرع 264.7 بلاعم RAW على الغطاء بكثافة 10⁶ خلايا لكل مليلتر ، واحتضان اللوحة طوال الليل في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم التالي ، استبدل الوسائط الموجودة في كل بئر ب 500 ميكرولتر من الوسائط الكاملة الطازجة ، ثم قم بمعالجة البلاعم مسبقا لمدة 30 دقيقة باستخدام التحكم في السيارة مثل DMSO أو مثبط كثرة الخلايا الكبيرة مثل EIPA. بعد ذلك ، لتعزيز تكشكشة الغشاء ، عالج الخلايا لمدة 30 دقيقة باستخدام محفزات كثرة الخلايا الكبيرة ، مثل محلول PMA 1 ميكرومولار أو 100 نانوغرام لكل مليلتر من عامل تحفيز مستعمرة البلاعم.

لإصلاح الخلايا لمسح المجهر الإلكتروني ، قم بشفط الوسائط من الآبار ، واغسل الأغطية مرتين باستخدام PBS المثلج. بعد ذلك ، قم باحتضان الغطاء في مثبت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بحضانة الليل عند 4 درجات مئوية.

في اليوم التالي ، دون إزعاج طبقة أحادية الخلية ، اغسل بلطف ، ثم احتضن الأغطية في 500 ميكرولتر من 0.1 مولار من الكاكوديلات الصوديوم لمدة 15 دقيقة. بعد غسلتين بسعة 500 ميكرولتر من الماء المقطر ، اغسل الغطاء مرتين في 500 ميكرولتر من سلسلة الإيثانول المتدرجة مع حضانة لمدة 10 دقائق في كل غسلة.

لإجراء تجفيف النقاط الحرجة ، ضع أغطية الغطاء في مجفف النقطة الحرجة ، وقم بتغطيتها بالإيثانول بنسبة 100٪ ، ثم اضغط على زر الطاقة ، وافتح خزان ثاني أكسيد الكربون. اضغط على زر التبريد لمدة 30 ثانية تقريبا حتى تنخفض درجة الحرارة إلى 0 درجة مئوية. ثم اضغط على الزر "تعبئة" حتى تظهر فقاعة في نافذة الغرفة.

بعد ذلك ، اضغط على زر التطهير حتى تختفي رائحة الإيثانول من عادم التطهير. ثم اضغط على الزر "بارد" مرة أخرى، حتى تنخفض درجة الحرارة إلى 0 درجة مئوية. أعد الضغط على زري التعبئة والإزالة لإيقاف تشغيلهما. ثم أغلق خزان ثاني أكسيد الكربون. أعد الضغط على زر التبريد لإيقاف تشغيله ، ثم اضغط على زر الحرارة. اضبط درجة الحرارة على 42 درجة مئوية والضغط على 1,200 رطل لكل بوصة مربعة.

بمجرد استقرار الضغط ودرجة الحرارة ، اضغط على زر النزيف للسماح للضغط بالانخفاض ببطء. بمجرد أن يصل ضغط الغرفة إلى 150 رطلا لكل بوصة مربعة ، اضغط على زر التهوية وانتظر حتى ينخفض الضغط إلى 0 رطل لكل بوصة مربعة. قم بإيقاف تشغيل مجفف النقطة الحرجة ، وقم بإزالة أغطية.

بعد ذلك ، باستخدام علامات تبويب لاصقة الكربون ، قم بتركيب أغطية على حوامل عينة الألومنيوم لمسح المجهر الإلكتروني. بعد ذلك ، انتقل إلى طلاء الرش باستخدام الذهب أو البلاديوم في مغطي الاخرق.

قم بتشغيل زر الطاقة الخاص بآلة الطلاء بالرش. بعد أن يصل الفراغ إلى 30 ملليتور ، اغسل الغرفة لإزالة الرطوبة والهواء عن طريق إيقاف تشغيل مفتاح الغاز وتدوير صمام الغاز الناعم عكس اتجاه عقارب الساعة. بمجرد زيادة الفراغ إلى 200 ملليتور ، قم بإيقاف تشغيل مفتاح الغاز وانتظر حتى يصل الفراغ إلى 30 ملليتور ، ثم اغسل الغرفة مرة أخرى لإزالة الرطوبة والهواء كما هو موضح. بعد شطف الغرفة ثلاث مرات ، اضغط على زر المؤقت واضبط مقبض الجهد حتى يقرأ المقياس 10 مللي أمبير. ثم قم بإزالة الغطية المطلية من الغرفة.

لتصور الكشكشة الغشائية وتحديدها كميا ، أدخل غطاء العينة في حجرة المجهر الإلكتروني الماسح. أغلق الباب واضغط على زر Evac. افتح برنامج تشغيل المجهر واضبط الجهد المتسارع على 15 كيلو فولت ومسافة العمل على 10 ملليمترات. اضغط على زر الإحداثيات وتحرك حول وحدة التحكم حتى تظهر الخلايا في وسط شاشة المراقبة. اضبط التكبير على 3500x، وقم بتصوير العينة بالنقر فوق الزر صورة.