الفحص المجهري الفلوري داخل الحيوية لدراسة تكوين الجلطات الوعائية الدقيقة

يعد الفحص المجهري الفلوري داخل الحيوية مفيدا لدراسة الحث السام الضوئي لتكوين الجلطة — جلطة دموية — في موقع إصابة الأوعية الدموية الدقيقة.

ابدأ بأخذ فأر مخدر أصلع محقون بعديد السكاريد السام الضوئي المسمى بالفلوروفور. ضع الماوس في وضع الانبطاح على منصة التدفئة للحفاظ على درجة الحرارة الفسيولوجية للدورة الدموية السليمة.

ضع الجزء القمي من الأذن تحت مجهر مضان داخل الحيوية. عند الإثارة بالضوء ، ينبعث الفلوروفور من التألق - مما يسمح بمراقبة تدفق الدم في الأوعية الدموية الدقيقة. زيادة شدة الضوء للحث على تكوين الجلطة.

يمتص الفلوروفور الضوء عالي الكثافة ويتفاعل مع الأكسجين الجزيئي لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية. تسبب هذه الجزيئات إجهادا مؤكسدا في الخلايا البطانية ، مما يؤدي إلى تلف الخلايا والتعرض للمصفوفة تحت البطانة.

تطلق الخلايا التالفة وسطاء تخثريين يربط الكولاجين المكشوف في المصفوفة تحت البطانية والصفائح الدموية المنتشرة ، والتي ترتبط بالوسطاء عبر مستقبلات محددة.

ينشط الارتباط الصفائح الدموية ، مما يتسبب في إطلاق جزيئات المستجيب التي تنشط وتجند الصفائح الدموية الأخرى المنتشرة في موقع الإصابة. ترتبط بروتينات الفيبرينوجين المنتشرة بمستقبلات الفيبرينوجين على الصفائح الدموية المنشطة - تربطها لتشكيل سدادة الصفائح الدموية.

تصور تدفق الدم المقيد لتأكيد سدادة الصفائح الدموية — الخطوة الأساسية لتكوين الجلطة.

ضع على المنصة تحت المجهر المجسم. استخدم التكبير 10X. للفحص المجهري للأذن اليمنى ، قم بإعداد الوريد الوداجي الأيسر عن طريق عمل شق 5 ملم في جلد الرقبة في اتجاه قحفي ذيلي. ثم استخدم الملقط الدقيق والمقص الدقيق لتشريح الأنسجة تحت الجلد. ثم حرر الوريد من المجيء دون لمس الوعاء.

الآن ، استخدم حقنة الأنسولين المعدة مسبقا لحقن صبغة الفلورسنت. أمسك جدار الوعاء بعناية باستخدام الملقط الدقيق دون ثقب الوريد. اختراق جدار الوعاء الدموي المنتفخ بإبرة المحقنة ، وحقن FITC-dextran عن طريق الوريد. اسحب الإبرة ، وأوقف النزيف باستخدام مسحات القطن. تجنب تلوث الأذن بالدم والصبغة.

انقل على لوح التسخين إلى هيكل زجاجي مع فتحة للوحة التسخين ومستوى بارتفاع 0.5 سم لوضع الأذن. ثبت في وضع الانبطاح على لوحة التسخين باستخدام ضمادة لاصقة. ضع الغضروف المحدب في قاعدة الأذن بجانب مستوى الأذن بحيث يمكن وضع الجزء القمي من الأذن بشكل مسطح على المستوى. أضف قطرة واحدة من أكوا بدرجة حرارة الغرفة إلى اللوحة الزجاجية العجزية. باستخدام مسحات القطن ، امتصاص قطرة الماء واترك القوى الشعرية تربط مستوى الأذن بالزجاج الزجاجي.

يجب وضع الأذن بشكل مسطح قدر الإمكان ، على الرغم من أن الغضروف يعطي الأذن شكلا محدبا. لذلك ، يجب وضع الجزء البعيد الأكثر مرونة فقط من الأذن على اللوح الزجاجي. لتجنب تلف الأنسجة وتسرب الصبغة المجمدة ، المس الأذن بأقل قدر ممكن بالملقط.

بعد ذلك ، أضف قطرة واحدة من الماء إلى الجانب الظهري المحدب من الأذن. ضع بعناية غطاء واحد على الأذن دون ضغط الأوعية القاعدية التي تدخل الأذن. استخدم مسحات قطنية لإزالة أكبر قدر ممكن من الماء من تحت الغطاء ، لتقليل المسافة بين الغطاء والأوعية المستهدفة للأذن.

ابدأ بضبط المجهر الفلوري داخل الحيوية لتصور FITC-dextran. انقل المعد إلى مكتب المجهر الفلوري داخل الحيوية. باستخدام تكبير 5X و 10X و 20X وشدة الضوء بنسبة 20٪ ، ابحث عن وعاء وريدي يبلغ قطره من 50 إلى 60 ميكرون وتدفق دم متقدم.

أضف قطرة واحدة من الماء بدرجة حرارة الغرفة إلى الغطاء للغمر في الماء بهدف التكبير 63X. مباشرة بعد تطبيق قطرة الماء ، ابدأ في تسجيل الوعاء لمدة 20 ثانية لتقييم خط الأساس للقطر وتدفق الدم. ابدأ تحريض الجلطة بعد 5 دقائق من حقن FITC-dextran. لهذا الغرض ، ارفع شدة الضوء إلى 100٪.

أثناء تحريض الجلطة السامة ضوئيا ، أغلق فتحة المجهر لمدة ثانيتين خلال فترة 30 ثانية للتحقق من انسداد تدفق الدم. إذا استمر تدفق الدم، فافتح الفتحة مرة أخرى. يصنف الوعاء على أنه مسدود إذا ظل التدفق ثابتا لمدة 30 ثانية أو أكثر ، أو إذا كان تدفق الدم رجعيا. حدد وسد خمسة أوعية لكل أذن في غضون ساعة واحدة بعد حقن FITC-dextran.