$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
لتصور بروتينات استجابة لتلف الحمض النووي المحددة عند كسر الحمض النووي المزدوج ، DSB ، المواقع التي تستخدم المجهر المناعي ، تبدأ بشرائح مجهرية تحتوي على طبقات أحادية للخلية البشرية أحادية النواة مع DSBs. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهايد.
عالج بمنظف غير أيوني ، وأغشية نفاذية للوصول إلى الأهداف داخل الخلايا. أضف محلول حجب يحتوي على البروتين ، مما يحجب مواقع الارتباط غير المحددة للخلايا. احتضان الأجسام المضادة الأولية التي ترتبط ببروتينات الاستجابة المستهدفة.
عالج بخليط من الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلوروفورات المختلفة للارتباط على وجه التحديد بالأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالبروتينات. صبغة الحمض النووي باستخدام DAPI. إضافة وسيط التركيب ؛ قم بتركيب الغطاء.
أثناء الفحص المجهري الفلوري ، يصل شعاع الضوء الساقط إلى مرشح الإثارة مما يسمح بمرور ضوء بطول موجة إثارة معين. عند الوصول إلى المرآة ثنائية اللون - مقسم الشعاع - ينعكس ضوء الإثارة بشكل انتقائي نحو العدسة الشيئية ، والتي تركز الضوء على العينة.
يثير ضوء الإثارة الساقط إلكترونات الفلوروفور إلى حالة طاقة أعلى. عند العودة إلى الحالة الأرضية ، تنبعث الإلكترونات من الضوء بطول موجي أطول ، يتم جمعها بواسطة العدسة الموضوعية ، وتعود إلى المرآة ثنائية اللون.
تسمح المرآة لضوء التألق المنبعث بالمرور عبر مرشح الانبعاث ، مما يسمح فقط لضوء التألق المطلوب بالوصول إلى الكاشف. معالجة الصور. قم بتحليل البؤر الفلورية الملونة المختلفة لتصور التوطين المشترك لبروتينات استجابة تلف الحمض النووي في موقع DSB.
قم بإعداد اثنين من الدوران الخلوي مع الخلايا أحادية النواة لعينات المريض عن طريق الطرد المركزي 1 × 105 خلايا لكل مستحضر. ثبت الخلايا ب 200 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة 10 دقائق.
بعد التثبيت ، اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من PBS لمدة خمس دقائق لكل منها على شاكر. بعد ذلك ، قم باختراق الخلايا ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ أوتوكسينول -9 لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من محلول مانع بنسبة 5٪ لمدة خمس دقائق على شاكر المختبر. قم بسد الخلايا في 30 مل من محلول حجب طازج بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة.
حافظ تثبيت الخلايا ونفاذيتها بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد و 0.1٪ أوتوكسينول -9 على بؤر جاما H2AX و 53BP1 بشكل واضح.
احتضان مستحضر واحد من الخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر H2AX وآخر تحضير للخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر H2AX وجسم مضاد للأرنب متعدد النسيلة مضاد ل 53BP1 بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
يوصى بشدة باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل Gamma H2AX و 53BP1 المثبتة.
بعد الحضانة ، اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من محلول مانع 2٪ لكل خمس دقائق على شاكر المختبر.
بعد ذلك ، احتضان المستحضر الأول للخلايا بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر من الماعز مترافق Alexa488 مخفف 1 في 500 في محلول حجب 2٪. احتضان المستحضر الثاني للخلايا بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر من الماعز المترافق Alexa488 وجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب من Alexa555 مخفف 1 في 500 في محلول مانع بنسبة 2٪.
اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من PBS على شاكر المختبر. قم بإزالة PBS وقم بتركيب الخلايا بوسيط تثبيت. بحذر ، ضع غطاء أعلى وسط التثبيت ، بحيث لا يتم تضمين فقاعات الهواء. انتظر ثلاث ساعات على الأقل حتى يتصلب وسط التركيب قبل تحليل الخلايا بواسطة الفحص المجهري الفلوري.
أخيرا ، قم بتحليل بؤر جاما H2AX و 53BP1 في نوى الخلية باستخدام مجهر مضان مزود بمرشحات ل DAPI و Alexa488 و Cy3 أثناء التصوير بتكبير موضوعي 100x.