التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي لتحديد الفسفرات المتعددة في البروتينات

تتضمن الفسفرات المتعددة في البروتين إضافة مجموعات الفوسفات إلى البروتين في مواضع مختلفة ، وتحديدا في بقايا السيرين والثريونين.

لتحديد الفسفرات المتعددة في البروتين ، ابدأ بأنبوب يحتوي على بروتينات مفسفرة مسمى بالنيتروجين -15 ، مما يساعد على تمييز هيدروجين الأميد عن الهيدروجينات الأخرى في البروتين.

أضف مركبا مرجعيا داخليا للرنين المغناطيسي النووي للقياس الدقيق لترددات الرنين النسبي. انقل الخليط إلى أنبوب رنين مغناطيسي نووي أو الرنين المغناطيسي النووي. أدخل الأنبوب في فتحة دوارة ، وضعه في مطياف الرنين المغناطيسي النووي.

يظهر وجود الفوسفات تأثيرات سحب الإلكترون في بقايا السيرين والثريونين المفسفرة. نتيجة لذلك ، يبدو أن هيدروجينات الأميد من المخلفات الفسفرية قد تم إزالتها بكثافة إلكترونية أقل مقارنة بهيدروجين الأميد الأخرى.

تواجه هيدروجينات الأميد ذات البيئات الإلكترونية المختلفة مجالات مغناطيسية تفاضلية حول النوى ، وتصل إلى حالات منخفضة الطاقة.

قم بتطبيق نبضة ترددات راديوية قصيرة لإثارة نوى الهيدروجين إلى حالة طاقة أعلى بتردد رنين محدد بناء على بيئتها الإلكترونية.

أثناء الاسترخاء ، تعود النوى إلى حالة طاقة منخفضة عن طريق إطلاق الطاقة الممتصة ، والتي يتم اكتشافها لإنتاج إشارة الرنين المغناطيسي النووي.

ارسم طيف الرنين المغناطيسي النووي ثنائي الأبعاد الذي يمثل هيدروجين الأميد الفردي.

قارن طيف البروتين الفسفوري مع البروتين غير الفسفري. يؤكد ظهور الرنين الإضافي في طيف الرنين المغناطيسي النووي للبروتين الفسفوري الفسفرة المتعددة.

قم بإذابة 4 ملليغرام من المجفف بالتجميد ¹⁵نيوتن و ¹³درجة مئوية المخصب ERK بفسفرة تاو في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي. أضف 5٪ أكسيد الديوتيريوم لحجب المجال لمطياف الرنين المغناطيسي النووي و 1 مليمولار TMSP كمرجع إشارة داخلي للرنين المغناطيسي النووي. أضف أيضا 10 ميكرولترات من محلول مخزون 40x من كوكتيل مثبط البروتياز الكامل.

انقل العينة في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي سعة 5 ملليلتر باستخدام حقنة إلكترونية بإبرة طويلة أو باستخدام ماصة باستور. أغلق أنبوب الرنين المغناطيسي النووي باستخدام المكبس. قم بإزالة أي فقاعات هواء محاصرة بين المكبس والسائل عن طريق تحريك المكبس.

ضع أنبوب الرنين المغناطيسي النووي في دوار. استخدم المقياس المناسب لضبط موضعه الرأسي في الدوار ، بحيث يكون معظم محلول العينة داخل ملف الرنين المغناطيسي النووي. بعد ذلك ، ابدأ تدفق الهواء في جهاز الرنين المغناطيسي النووي بالنقر فوق "رفع" في نافذة نظام التحكم في المغناطيس. ضع الدوار بحذر مع الأنبوب في تدفق الهواء في الجزء العلوي من تجويف المغناطيس ، ثم أوقف تدفق الهواء ، واترك الأنبوب ينزل في مكانه داخل رأس المسبار داخل المغناطيس.

بعد السماح للعينة بالتوازن إلى 25 درجة مئوية ، اكتب "atmm" في سطر الأوامر لإجراء ضبط شبه تلقائي ومطابقة رأس المسبار لتحسين نقل الطاقة. ثم انقر فوق "قفل" في نافذة نظام التحكم في المغناطيس لإشراك قفل تردد المجال لمقياس الطيف.

ابدأ إجراء اللحمة لتحسين تجانس المجال المغناطيسي في موضع العينة عن طريق كتابة "واجهة المستخدم الرسومية topshim" أولا في سطر الأوامر لفتح نافذة الرقائق. ثم انقر فوق "ابدأ" في نافذة الرقائق. تحقق من الانحراف المعياري الصفري المتبقي B للتحقق من أن الحشوات هي الأمثل.

بعد ذلك ، قم بمعايرة المعلمة P1 ، وهي طول نبضة الترددات الراديوية للبروتون بالميكروثانية. هذه المعلمة ضرورية للحصول على دوران 90 درجة لمغنطة دوران البروتون. استهدف النبضة بزاوية 360 درجة باستخدام طيف أحادي البعد من بروتونات الماء.

اضبط إزاحة التردد عن طريق ضبط المعلمة 01 على تردد ماء البروتون في الطيف أحادي البعد. أخيرا ، ابدأ في الحصول على طيف بروتون أحادي البعد عن طريق كتابة "zg" في سطر الأوامر.