اختبار مناعي مباشر قائم على التحليل الطيفي رامان للكشف عن مستضد معين

ابدأ باحتضان جزيئات صبغ مراسل رامان بجزيئات الذهب النانوية للصحفيين للارتباط بالجسيمات النانوية.

أضف البولي إيثيلين جلايكول ، الأجسام المضادة المترافقة مع PEG الخاصة بالمستضد المستهدف. ترتبط الأجسام المضادة تساهميا بالجسيمات النانوية من خلال ربط ثاني كبريتيد الذهب. أضف PEGs المترافقة بالثيول لمنع مواقع الجسيمات النانوية المتبقية ومنع تراكم الجسيمات النانوية ، وتشكيل مجسات الجسيمات النانوية.

قم بتغطية آبار لوحة المقايسة المناعية بالمستضد المستهدف. سد مواقع الصفائح المتبقية بمحلول يحتوي على البروتينات. أضف مجسات الجسيمات النانوية. إجراء التخفيف التسلسلي للمسبار عبر الآبار. احتضان الأجسام المضادة في المجسات لترتبط بالمستضدات ، وتشكل مجمعات.

استخدم مجهر رامان لتحديد الاستجابة البصرية للمسبار. يثير الليزر أحادي اللون الساقط الإلكترونات السطحية للجسيمات النانوية الذهبية ويسبب تذبذبها ، مما يخلق مجالا كهرومغناطيسيا محليا عاليا على سطح المسبار.

يتفاعل شعاع الحادث ومراسلو رامان ، مما يتسبب في تحسين الضوء غير المرن أو تشتت رامان بأطوال موجية وترددات مختلفة بسبب المجال الكهرومغناطيسي المعزز. تستخدم إشارة رامان المنبعثة بشكل غير مرن لتوليد طيف رامان.

ارسم المنطقة الطيفية لقمة مراسل رامان مقابل تركيز المسبار للعثور على الحد الأدنى للكشف عن المسبار وتسهيل الكشف الأكثر حساسية عن المستضد.

من أجل تحضير مجسات رامان ، قم أولا بعمل دفعتين سعة 1.5 مليلتر من الجسيمات النانوية للذهب ومراسل رامان بتركيزات محددة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

يتم ذلك من خلال الجمع بين مراسل رامان ومحاليل الجسيمات النانوية الذهبية والسماح لها بالارتباط لأكثر من 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف محلول الأجسام المضادة PEGylated إلى أحد حلول الجسيمات النانوية الذهبية المرتبطة بالمراسل لإنشاء نسبة 200 إلى 1 من الأجسام المضادة إلى الجسيمات. سيكون هذا الحل لعينات الاختبار.

في أنبوب منفصل للطرد المركزي الدقيق ، أضف مستضد PEGylated إلى محلول الجسيمات النانوية الذهبية الآخر المرتبط بالتقرير بنسبة 200 إلى 1 من المستضد إلى الجسيمات لاستخدامها كعنصر تحكم. احتضان كلا المحاللين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بحظر المواقع المتبقية على سطح الجسيمات النانوية. لتحقيق ذلك ، أولا ، قم بإذابة الميثوكسي البولي إيثيلين جلايكول ثيول الصلب إلى تركيز 200 ميكرومولار باستخدام ماء HPLC. دوامة المحلول حتى يذوب الثيول تماما. بعد ذلك ، أضف محلول الثيول بنسبة 40,000 إلى 1 إلى محاليل الأجسام المضادة PEG المرتبطة بالجسيمات النانوية ، واحتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لضمان حظر المواقع المتبقية على الجسيمات النانوية الذهبية.

بعد ذلك ، استرجع مجسات رامان الوظيفية عن طريق الطرد المركزي للجزيئات في أنابيب الطرد المركزي منخفضة الحدود بحيث يكون المادة الطافية واضحة. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينة ولكن احرص على عدم إزعاج الجسيمات النانوية. ثم أعد تعليق الجسيمات النانوية ب 1 مليلتر من PBS.

قم بتقدير تركيز الجسيمات النانوية للذهب عن طريق أخذ قياس مرئي للأشعة فوق البنفسجية من حوالي ثلاثة ميكرولترات من المحلول وقارن النتائج بتلك الناتجة عن تركيز الجسيمات النانوية الذهبية المعروفة لأن هذه علاقة خطية.

إذا لم يتم حظر الجسيمات النانوية بشكل كاف ، فسوف تتجمع بسبب قوى الالتصاق بين الجسيمات التي تشير إلى إضافة الكواشف بتركيزات غير صحيحة. عادة ما يكون المحلول بلون أحمر غامق ولكن التجميع يخلق لونا رماديا.

اضبط الحجم بحيث تكون المحاليل النهائية على الأقل 1 × 10¹¹ جسيما لكل مليلتر وقم بتخزين المحاليل عند 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامها لتشغيل لوحة المقايسة المناعية. استخدم هذه الحلول في غضون أسبوع واحد. أولا ، قم بإعداد ما يكفي من المستضد المخفف لملء آبار البوليسترين. ثم ، قم بتدوير المحلول وأضف المحلول على الفور إلى آبار الألواح.

اسمح للمستضد بالارتباط بالألواح لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول المستضد الزائد عن طريق إلقاء المحلول ، وضرب اللوحة على سطح طاولة مغطى بمنشفة ورقية. أضف TBST إلى الآبار لغسل السطح. بعد ذلك ، قم بإزالة الغسيل عن طريق إلقاء المحلول مرة أخرى وضرب اللوحة على سطح طاولة مغطى بمنشفة ورقية.

بعد ذلك ، قم بحظر مواقع الربط المتبقية على اللوحة لمنع الارتباط غير المحدد عن طريق إضافة 70 ميكرولترا من محلول حجب HSA إلى كل بئر من اللوحة ، واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الانسداد واشطف الطبق ثلاث مرات باستخدام TBST ، كما هو موضح سابقا. بعد إزالة الشطف النهائي ، قم بتغطية الطبق واحفظه جافا على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.

أضف 140 ميكرولترا من الجسيمات النانوية للمسبار المعدة مسبقا في العمود الأول من صفيحة مكونة من 96 بئرا ، مع وضع الجسيمات النانوية للاختبار في الصفوف الخمسة الأولى والجسيمات النانوية للتحكم في الصفوف الثلاثة الأخيرة. أضف 70 ميكرولترا من PBS إلى جميع الأعمدة الأخرى.

قم بتخفيف كل عمود باستخدام التخفيف التسلسلي من 1 إلى 2. ابدأ بأخذ 70 ميكرولتر من العمود الأول ، وخلطه مع العمود الثاني. ثم خذ 70 ميكرولترا من العمود الثاني وأضفه إلى العمود الثالث ، وهكذا. اترك الطبق يحتضن لمدة ساعة على الأقل.

بعد ذلك ، قم بإزالة مجسات الجسيمات النانوية غير المرتبطة واغسل اللوحة باستخدام TBST خمس مرات كما هو موضح سابقا. بعد الغسيل النهائي ، أضف 70 ميكرولترا من PBS إلى كل بئر وقم بتغطية اللوحة بختم اللوحة. تأكد من أن عينات التحكم واضحة. في حالة حدوث ارتباط غير محدد ، سيكون لعينات التحكم لون مماثل لعينات الاختبار.

باستخدام مجهر رامان المقلوب ، ركز الهدف على سطح البئر الذي يحتوي على مجسات الجسيمات النانوية الذهبية. الحصول على أطياف رامان من البئر. اجمع طيفا يتراوح من 1800 سنتيمتر معكوس إلى 400 سنتيمتر معكوس وكرر ذلك لكل بئر. أخيرا ، اتبع الخطوات الواردة في القسم الأخير من بروتوكول النص المصاحب لتحديد حساسية الإعداد.