PCR الأمثل القائم على الكشف عن المفطورة

الهدف العام من هذا الإجراء هو التوضيح المرئي لخطوات استخدام طقم الكشف عن المايكوبلازما بتقنية PCR من نوع lookout والمحسّن للكشف عن تلوث المايكوبلازما. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تسخين العينات إلى 95 °C لتعطيل أي جزيئات DNA قد تجعل القالب المطلوب غير مناسب لعملية PCR. بعد ذلك، يتم تحضير العينات لعملية PCR باستخدام الأنابيب المرفقة والمشفرة مسبقاً بالنيوكليوتيدات، والبادئات (primers)، وDNA للتحكم الداخلي.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في التدوير الحراري تحت ظروف تم تحسينها بعناية لتحقيق أقصى درجة من الحساسية والقضاء على التضخيم غير النوعي. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج لتحديد ما إذا كانت العينات المعنية ملوثة بالميكوبلازما (mycoplasma) من خلال التقييم باستخدام الفصل الكهربائي لهلام الأجاروز. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن الكواشف تكون جاهزة مسبقاً وفي أنابيب PCR عالية الجودة.

وهذا يجعل العملية أكثر ملاءمة وكفاءة. وميزة أخرى لهذه المجموعة هي أنها تتطلب أقل من جينومين من الميكوبلازما لكل µL من العينة للكشف عن التلوث. عند تنفيذ إجراء الكشف عن الميكوبلازما، من المهم تجنب أي تلوث محتمل من خلال ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة لتقليل تعرض الجلد إلى أدنى حد، والتأكد من أن جميع الكواشف المستخدمة خالية من التلوث، والحفاظ على تقنية تعقيم مناسبة في جميع الأوقات.

يمكن إجراء العملية إما مباشرة على طافيات المزارع الخلوية، أو يمكن تحضير العينات لاستخدامها في تاريخ لاحق. ولتحضير العينات للاستخدام اللاحق، يتم وضع 100 µL من كل طافية في أنبوب تضخيم معقم وتحضينها عند 95 °C لمدة خمس دقائق. وبعد التحضين، يمكن تخزين العينات في درجة حرارة تتراوح من 2 إلى 8 °C لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

قبل اختبار العينات مباشرة، قم بإجراء عملية طرد مركزي قصيرة لترسيب أي بقايا خلوية. ولتحضير العينات لجهاز PCR أولاً، حدد الحجم الإجمالي لمنظم إعادة تمييه DNA polymerase المطلوب للتفاعلات. يجب إضافة وحدة واحدة من DNA polymerase لكل تفاعل إلى الحجم المناسب من منظم إعادة التمييه، والذي سيختلف باختلاف tac المستخدم في هذا العرض التوضيحي؛ سيتم استخدام jumpstart TAC D 93 0 7 في خمسة تفاعلات، وهي ثلاث عينات بالإضافة إلى ضابط إيجابي واحد وضابط سلبي واحد.

ضع الحجم المحسوب من DNA polymerase في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف، ثم أضف إليه الحجم المحسوب من محلول إعادة التميؤ (rehydration buffer). اخلط DNA polymerase ومحلول إعادة التميؤ بلطف عن طريق نقر الأنبوب. لا تستخدم جهاز الخلط الدوامي (vortex) لهذا الخليط.

استخدم أنابيب التفاعل الشفافة المرفقة في الطقم لتحضير العينة والضابط السلبي. تحتوي أنابيب التفاعل هذه بالفعل على النيوكليوتيدات والبادئات والحمض النووي للضابط الداخلي؛ لذا قم بنقل 23 µL من محلول إعادة ترطيب DNA polymerase الذي تم تحضيره مسبقاً باستخدام الماصة. اخلط المحتويات في كل من أنابيب العينات وأنابيب الضابط السلبي.

بعد ذلك، أضف 2 µL من الماء الخالي من DNA إلى العينة الضابطة السالبة و2 µL من كل عينة إلى أنابيب العينات المخصصة لها. امزج المحتويات عن طريق نقر الأنابيب خفيفاً، مع مراعاة عدم استخدام جهاز الرج المداري (vortex) للمحتويات.

لتحضير الضابط الموجب، استخدم أنابيب التفاعل الوردية المرفقة في الطقم. تحتوي أنابيب التفاعل هذه بالفعل على النيوكليوتيدات والبادئات والحمض النووي للضابط الداخلي؛ أضف 25 µL من خليط منظم إعادة إماهة DNA polymerase إلى أنبوب التفاعل. اخلط المحتويات عن طريق نقر الأنبوب، ويجب عدم استخدام جهاز مزج العينات (vortex) للمحتويات.

بعد ذلك، تُحضن أنابيب الضابط الموجب، والضابط السالب، وأنابيب العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. وبعد مرور خمس دقائق، تُنقل جميع أنابيب التفاعل إلى جهاز التدوير الحراري. وبالنسبة لتفاعل PCR، تُضبط الظروف التالية لـ 40 دورة.

درجة حرارة 94 °C لمدة 30 ثانية. درجة حرارة 55 °C لمدة 30 ثانية ودرجة حرارة 72 °C لمدة 40 ثانية. لا يلزم إجراء خطوة التنشيط عند استخدام Jumpstart tack.

بمجرد اكتمال دورات PCR، أخرج العينات من جهاز التدوير الحراري وضعها على الثلج لتبرد حتى تصل درجة حرارتها إلى 4 إلى 8 درجة مئوية. يمكن بعد ذلك تحميل العينات على هلام أغروز لإجراء الفصل الكهربائي؛ قم بتحميل 8 µL مباشرة من كل تفاعل PCR في مسار منفصل. لا داعي لإضافة محلول التحميل والصبغة قبل تحميل العينات لأنها مدرجة بالفعل في أنابيب التفاعل.

أوقف عملية الرحلان الكهربائي بعد أن يهاجر صبغ التتبع لمسافة تتراوح بين 2.5 إلى ثلاثة سنتيمترات. تظهر النتائج التمثيلية للكشف عن الميكوبلازما بواسطة PCR في هذه الصورة لمسار هلام الأجاروز. يمثل المسار اثنان الضابط السلبي، والذي يجب أن يظهر حزمة عند حوالي 481 base pairs.

يعد غياب حزمة الضابط السلبي عند 481 زوجاً قاعدياً مؤشراً جيداً على أن تقنية TAC المستخدمة لم تكن حساسة بما يكفي. ستظهر العينات الإيجابية لـ Mycoplasma حزمات في نطاق 270 زائد أو ناقص ثمانية أزواج قاعدية كما هو موضح في المسارات من ثلاثة إلى ستة. ستكون الحزمة كثيفة في العينات شديدة التلوث وباهتة في العينات قليلة التلوث.

تحتوي جميع العينات على ضابط داخلي سلبي لإثبات أن تفاعل PCR قد تم كما هو متوقع. ومن الطبيعي ملاحظة غياب الضابط الداخلي في العينات شديدة التلوث. ويعد غياب الحزمة في كل من النطاقين الموجب والسالب، كما هو موضح في الممر السابع، مؤشراً جيداً على وجود تثبيط في العينات.

في حال تثبيط العينة، يمكن إزالة مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عن طريق إجراء استخلاص للحمض النووي (DNA). بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ جميع الخطوات الضرورية الموضحة في إجراءات المجموعة، بالإضافة إلى كيفية تفسير النتائج واستكشاف الأخطاء وإصلاحها عند الضرورة.