PCR الأمثل القائم على الكشف عن المفطورة
يونيو 20, 2011
الكشف عن بالمرصاد PCR المفطورة كيت يستخدم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، التي أنشئت بوصفها الأسلوب المفضل لأعلى حساسية في الكشف عن التلوث المفطورة ، Acholeplasma والميورة في الثقافات الأخرى وخلية خلية ثقافة تستمد البيولوجية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح خطوات استخدام مجموعة الكشف عن الميكوبلازما PCR للمراقبة المحسنة للكشف عن تلوث الميكوبلازما. يتم تحقيق ذلك عن طريق تسخين العينات أولا إلى 95 درجة مئوية لتعطيل أي جزيئات DNA يمكن أن تجعل القالب المطلوب غير مناسب لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد ذلك ، قم بإعداد العينات ل PCR باستخدام الأنابيب المتوفرة المشفرة مسبقا بالنيوكليوتيدات والبادئات والحمض النووي للتحكم الداخلي.
الخطوة الثالثة من الإجراء هي دورة درجة الحرارة في ظل ظروف محسنة بعناية لإعطاء أكبر قدر من الحساسية والقضاء على التضخيم غير المحدد. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج لتحديد ما إذا كانت العينات المعنية ملوثة بالميكوبلازما من خلال التقييم بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام الزراعي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أن الكواشف عبارة عن أنابيب PCR مائية وعالية الجودة.
هذا يجعلها أكثر ملاءمة وكفاءة. ميزة أخرى لهذه المجموعة هي أنها تتطلب أقل من جينومين للميكوبلازما لكل ميكرولتر من العينة للكشف عن التلوث. عند إجراء إجراء الكشف عن الميكوبلازما ، من المهم تجنب أي تلوث محتمل عند الاقتضاء معدات الحماية الشخصية للحفاظ على تعرض الجلد إلى الحد الأدنى ، والتأكد من أن جميع الكواشف المستخدمة خالية من التلوث والحفاظ على تقنية التعقيم المناسبة في جميع الأوقات.
يمكن إجراء الإجراء مباشرة على المواد الطافية لزراعة الخلايا أو يمكن تحضير عينات للاستخدام في وقت لاحق. لتحضير عينات للاستخدام لاحقا ، ضع 100 ميكرولتر من كل مادة طافية في أنبوب تضخيم معقم واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، يمكن تخزين العينات عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
قبل اختبار العينات مباشرة ، قم بعمل الطرد المركزي لفترة وجيزة لتكسير أي حطام خلوي. لتحضير عينات ل تفاعل البوليميراز المتسلسل أولا ، حدد الحجم الإجمالي للمخزن المؤقت لمعالجة بوليميراز الحمض النووي المطلوب للتفاعلات. يجب إضافة وحدة واحدة من بوليميراز الحمض النووي لكل تفاعل إلى الحجم المناسب من المخزن المؤقت للإماهة ، والذي سيختلف مع المسار الكهربائي المستخدم في هذا العرض التوضيحي سيتم استخدام TAC D 93 0 7 في خمسة تفاعلات ، ثلاث عينات بالإضافة إلى عنصر تحكم إيجابي واحد وتحكم سلبي واحد.
ضع الحجم المحسوب لبوليميراز الحمض النووي في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف واتبع الحجم المحسوب لمخزن الجفاف. امزج المخزن المؤقت لترطيب بوليميراز الحمض النووي برفق عن طريق النقر على الأنبوب. لا تقم بدوامة هذا الخليط.
استخدم أنابيب التفاعل الشفافة المتوفرة في المجموعة لإعداد التحكم السلبي والعينات. تحتوي أنابيب التفاعل هذه بالفعل على النيوكليوتيدات والبادئات وماصة الحمض النووي للتحكم الداخلي 23 ميكرولترا من المخزن المؤقت لمعالجة مرطب بوليميراز الحمض النووي المعد مسبقا. امزج كل من أنابيب التحكم السلبية والعينة.
ثم أضف ميكرولترين من الماء الخالي من الحمض النووي إلى عنصر التحكم السلبي وميكرولترين من كل عينة إلى أنابيب العينة المعنية. امزج المحتويات عن طريق النقر على الأنابيب. لا ينبغي أن تكون المحتويات دوامة.
لإعداد التحكم الإيجابي ، استخدم أنابيب التفاعل الوردي المتوفرة في المجموعة. تحتوي أنابيب التفاعل هذه بالفعل على النيوكليوتيدات والبادئات والحمض النووي للتحكم الداخلي عند 25 ميكرولترا من مزيج مخزن مياه بوليميراز الحمض النووي إلى أنبوب التفاعل. امزج المحتويات عن طريق النقر على محتويات الأنبوب لا ينبغي أن تكون دوامة.
ثم احتضان التحكم الإيجابي والتحكم السلبي وأنابيب العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، انقل جميع أنابيب التفاعل إلى دورة حرارية. بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، قم بتعيين الشروط التالية لمدة 40 دورة.
94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 40 ثانية. خطوة التنشيط غير مطلوبة عند استخدام Jumpstart tack.
بمجرد اكتمال دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإزالة العينات من جهاز التدوير الحراري وضعها على الجليد لتبرد إلى أربع إلى ثماني درجات مئوية. يمكن بعد ذلك تحميل العينات على هلام agros للرحلان الكهربائي ، وتحميل ثمانية ميكرولترات مباشرة لكل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في حارة منفصلة. تحميل. لا يلزم إضافة المخزن المؤقت والصبغة قبل تحميل العينات لأنهما مضمنان في أنابيب التفاعل.
أوقف الرحلان الكهربائي بعد أن تنتقل صبغة التتبع من 2.5 إلى ثلاثة سنتيمترات. تظهر النتائج التمثيلية للكشف عن الميكوبلازما عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في هذه الصورة لممر هلام aros. اثنان هو عنصر التحكم السلبي ، والذي يجب أن يظهر نطاقا عند حوالي 481 زوجا أساسيا.
يعدعدم وجود نطاق التحكم السلبي عند 481 زوجا أساسيا مؤشرا جيدا على أن TAC المستخدم لم يكن حساسا بدرجة كافية. ستظهر العينات الموجبة للميكوبلازما نطاقات في حدود 270 زائد أو ناقص ثمانية أزواج أساسية كما هو موضح في الممرات من ثلاثة إلى ستة. سيكون الشريط ثقيلا للعينات شديدة التلوث وباهتا للعينات الملوثة بشكل طفيف.
تحتوي جميع العينات على عنصر تحكم سلبي داخلي لإثبات أن تفاعل البوليميراز المتسلسل حدث كما هو متوقع. من الطبيعي أن نرى غياب الرقابة الداخلية على العينات شديدة التلوث. يعد عدم وجود نطاق على كل من النطاق الموجب والسلبي كما هو موضح في الممر السابع مؤشرا جيدا على تثبيط العينات.
إذا تم تثبيط العينة. يمكن إزالة مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إجراء استخراج الحمض النووي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ جميع الخطوات الضرورية الموضحة في إجراء المجموعة ، بالإضافة إلى تفسير النتائج واستكشاف الأخطاء وإصلاحها عند الضرورة.
نظرة عامة
مجموعة LookOut Mycoplasma PCR للكشف هي مصممة للكشف الحساس عن تلوث الميكوبلازما في ثقافات الخلايا. توضح هذه الإجراء الخطوات لاستخدام المجموعة، بما في ذلك تحضير العينات وتكبير PCR.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- ثقافة الخلايا
- البيولوجيا الجزيئية
الخلفية
- يمكن أن يؤثر تلوث الميكوبلازما بشكل كبير على نتائج ثقافة الخلايا.
- يُفضل استخدام طريقة PCR بسبب حساسيتها العالية في كشف الملوثات.
- تبسط مجموعة LookOut Mycoplasma PCR للكشف عملية الكشف.
- تقنيات مطهرة مناسبة ضرورية لتجنب التلوث أثناء الاختبار.
غرض الدراسة
- لتوضيح استخدام مجموعة LookOut Mycoplasma PCR للكشف.
- لتوفير طريقة موثوقة لكشف تلوث الميكوبلازما.
- لتحديد خطوات تحضير العينات وتنفيذ PCR.
الطرق المستخدمة
- تسخين العينات لتعطيل جزيئات الحمض النووي.
- تحضير العينات باستخدام أنابيب مسبقة الترميز تحتوي على الكواشف اللازمة.
- إجراء دورة درجات الحرارة لتكبير PCR.
- تقييم النتائج باستخدام رحلان هلامي أغاروز.
النتائج الرئيسية
- تظهر العينات الإيجابية للميكوبلازما نطاقات مميزة في نتائج PCR.
- يجب أن تظهر الضوابط السلبية حجم نطاق محدد يشير إلى عدم وجود تلوث.
- يمكن أن تشير غياب النطاقات إلى تثبيط العينة أو عدم كفاية الحساسية.
- تؤكد الضوابط الداخلية أن عملية PCR كانت ناجحة.
الاستنتاجات
- تعتبر مجموعة LookOut Mycoplasma PCR للكشف فعالة في كشف التلوث.
- يعتبر التعامل السليم مع العينات والتقنية ضروريين للحصول على نتائج دقيقة.
- يمكن أن توجه النتائج إلى إجراءات إضافية لضمان سلامة ثقافة الخلايا.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Mycoplasma contamination poses a significant risk to data integrity in cell-based research, potentially confounding experimental outcomes and wasting resources. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit provides a highly sensitive, rapid method for routine screening, enabling early detection and intervention. This supports predictive confidence in cell line quality and reduces the likelihood of propagating contaminated cultures through discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by ensuring cell line purity, reducing false phenotypes linked to contamination.
- Operational Value: Supports functional target validation through reliable, contamination-free models that maintain consistent proliferation and metabolic profiles.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by confirming absence of mycoplasma-induced artifacts in proliferation or signaling assays.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through routine use of a sensitive, standardized detection method with internal controls.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant system integrity by preventing chromosomal aberrations and metabolic alterations that could skew preclinical efficacy or toxicity readouts.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing a QC checkpoint before transitioning cultures to in vivo studies or IND-enabling work.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early biology to lead identification, serving as a gatekeeping step for culture integrity before compound screening or mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by ensuring observed phenotypes are due to experimental variables, not contamination-induced artifacts.
- Screening: Enables assay readiness through rapid, sensitive detection that allows high-throughput testing of cell line banks with minimal false negatives.
- Analytics: Provides quantitative output via gel electrophoresis band intensity, allowing semi-quantitative assessment of contamination load for troubleshooting.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by ensuring that toxicology or pharmacology studies use cultures free of mycoplasma-driven variability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable QC platform across departments, supporting centralized cell line management and reducing redundant testing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity from contamination-related phenotypes.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability through pre-coded tubes and internal controls, minimizing user error and batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early warning of contamination, preventing investment in flawed datasets.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of cell lines, directing resources toward validated models and reducing late-stage attrition due to biological noise.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise for PCR setup and gel electrophoresis interpretation.
- Needs thermal cycler and agarose gel electrophoresis infrastructure with UV imaging capability.
- Demands strict aseptic technique and segregated pre-/post-PCR areas to prevent amplicon contamination.
- Requires training on internal control interpretation to distinguish true negatives from PCR inhibition.
- Limited to nucleic acid detection; does not assess viability or species identity without follow-up sequencing.
