عزل الخلايا الليمفاوية من رقعة Peyer's Eye

بقع باير ، PPs ، مجاميع الأنسجة اللمفاوية المنظمة في جدار الأمعاء الدقيقة ، على خلايا مناعية بما في ذلك الخلايا الليمفاوية البائية والخلايا الليمفاوية التائية والخلايا المتغصنة والضامة.

لعزل الخلايا الليمفاوية عن PPs للفأر ، ابدأ بفأر قتل رحيم. شق جدار البطن ، وتعريض التجويف البريتوني. حدد موقع الأعور. قم بتشريح الوصلة اللفائفية لفصل الأعور عن الأمعاء الدقيقة.

استئصال المساريق وشق الأمعاء الدقيقة عند الاثني عشر لإزالة الأمعاء الدقيقة من التجويف البريتوني. ضع الأمعاء الدقيقة في صفيحة متعددة الآبار تحتوي على وسط مبرد واشطفها لإزالة الحطام.

ضع الأمعاء الدقيقة بحيث يكون الجانب المساريقي متجها لأسفل ، ورطيبها بوسط للحفاظ على ترطيب الأنسجة. حدد PPs - الركام الأبيض متعدد الفصص على الجانب المضاد للمساريقي من جدار الأمعاء.

استئصال PPs بعناية ، باستثناء أنسجة الأمعاء المحيطة. نقل إلى أنبوب يحتوي على وسط. احتضان تحت التحريض المستمر. تعمل خطوة التحريض هذه على فصل المخاط وحطام الخلايا وأي مادة برازية عن PPs ، وبالتالي تحسين تعافي الخلايا الليمفاوية PP.

بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى مصفاة خلوية بحجم شبكة مناسب. قم بتعطيل PPs بلطف وتحرير الخلايا. اغسل بالوسط من خلال المصفاة للحصول على تعليق الخلايا الليمفاوية أحادي الخلية. الطرد المركزي التعليق عند درجة حرارة منخفضة للحفاظ على استقرار الخلية.

أعد تعليق الخلايا الليمفاوية في وسط ، واستخدمها لمزيد من التحليل.

ابدأ بوضع الفأر في وضع ضعيف ، وتعقيم البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بعمل شق في البطن في خط الوسط عبر الجلد والصفاق من العانة إلى القفص الصدري لفتح التجويف البريتوني وتحديد موقع الأعور والوصلة اللفائفية.

قم بعمل قطع بعيد قدر الإمكان ، عند التقاطع لفصل الأمعاء الدقيقة عن الأعور ، وقطع المساريق بالمقص لإزالة الأمعاء الدقيقة بأكملها بعناية حتى العضلة العاصرة البوابية.

قص الوصلة بين البواب والاثني عشر لفصل الأمعاء الدقيقة تماما عن تجويف البطن ، ووضع الأمعاء الدقيقة المعزولة في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار تحتوي على وسط RPMI بارد ، مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ أو FBS على الجليد. بعد ذلك ، حرك الأنسجة برفق يدويا حتى تغمر جميع الأجزاء في الوسط البارد.

عندما يتم حصاد الأمعاء بالكامل، استخدم الملقط لالتقاط الدهون المساريقية في إحدى حواف الأمعاء ووضع العينة — الجانب المساريقي لأسفل — على منشفة ورقية. بلل الجزء المعوي بالكامل باستخدام RPMI بالإضافة إلى 10٪ FBS لتجنب جفاف الأنسجة والالتصاق ، وحدد موقع بقع Peyer ، والتي تظهر على شكل مجاميع بيضاء متعددة الفصوص ذات شكل يشبه القرنبيط على الجانب المضاد للمساريقي من جدار الأمعاء.

لحصاد بقع باير ، استخدم مقصا جراحيا منحنيا بحيث يكون المنحنى متجها لأعلى لاستئصال كل رقعة برفق من حدودها البعيدة والقريبة ، مع الحرص على استبعاد أنسجة الأمعاء المحيطة ، ووضع بقع باير في آبار فردية من صفيحة مكونة من 12 بئرا تحتوي على RPMI مثلج بالإضافة إلى 10٪ FBS ، على الجليد ، أثناء جمعها.

عندما يتم الحصول على جميع البقع ، استخدم المقص لقطع طرف طرف ماصة دقيقة سعة 1 مليلتر بحيث يكون القطر كبيرا بما يكفي لشفط بقع باير الفردية ، ونقل بقع باير إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 150 مليلتر لكل فأر ، يحتوي على 25 مل من 37 درجة مئوية RPMI بالإضافة إلى 10٪ FBS.

بعد ذلك ، ضع الأنابيب في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية مع تحريك مستمر عند 125 إلى 150 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. في نهاية التحريض ، انقل بقع باير إلى مصفاة خلية 140 ميكرومتر لكل فأر ، واستخدم الطرف المطاطي لمكبس حقنة 110 مليلتر لكل لتعطيل بقع باير برفق من خلال الشبكة إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 50 مل.

اشطف المصافي ب 15 إلى 20 مل من RPMI البارد بالإضافة إلى 10٪ FBS ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من المادة الطافية بعناية ، أعد تعليق الخلايا عند حوالي 1 × 10⁷ خلايا لكل مليلتر من RPMI بالإضافة إلى تركيز FBS 10٪ للعد. بعد ذلك ، قم بنقل 2 إلى 2.5 × 10⁶ خلايا لكل 200 ميكرو لتر من الوسط ، إلى كل بئر من صفيحة سفلية مستديرة مكونة من 96 بئرا ، وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي.