عزل الخلايا الليمفاوية من رقعة Peyer's Eye
JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 6:02 د • July 8th, 2025
بقع باير ، PPs ، مجاميع الأنسجة اللمفاوية المنظمة في جدار الأمعاء الدقيقة ، على خلايا مناعية بما في ذلك الخلايا الليمفاوية البائية والخلايا الليمفاوية التائية والخلايا المتغصنة والضامة.
لعزل الخلايا الليمفاوية عن PPs للفأر ، ابدأ بفأر قتل رحيم. شق جدار البطن ، وتعريض التجويف البريتوني. حدد موقع الأعور. قم بتشريح الوصلة اللفائفية لفصل الأعور عن الأمعاء الدقيقة.
استئصال المساريق وشق الأمعاء الدقيقة عند الاثني عشر لإزالة الأمعاء الدقيقة من التجويف البريتوني. ضع الأمعاء الدقيقة في صفيحة متعددة الآبار تحتوي على وسط مبرد واشطفها لإزالة الحطام.
ضع الأمعاء الدقيقة بحيث يكون الجانب المساريقي متجها لأسفل ، ورطيبها بوسط للحفاظ على ترطيب الأنسجة. حدد PPs - الركام الأبيض متعدد الفصص على الجانب المضاد للمساريقي من جدار الأمعاء.
استئصال PPs بعناية ، باستثناء أنسجة الأمعاء المحيطة. نقل إلى أنبوب يحتوي على وسط. احتضان تحت التحريض المستمر. تعمل خطوة التحريض هذه على فصل المخاط وحطام الخلايا وأي مادة برازية عن PPs ، وبالتالي تحسين تعافي الخلايا الليمفاوية PP.
بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى مصفاة خلوية بحجم شبكة مناسب. قم بتعطيل PPs بلطف وتحرير الخلايا. اغسل بالوسط من خلال المصفاة للحصول على تعليق الخلايا الليمفاوية أحادي الخلية. الطرد المركزي التعليق عند درجة حرارة منخفضة للحفاظ على استقرار الخلية.
أعد تعليق الخلايا الليمفاوية في وسط ، واستخدمها لمزيد من التحليل.
ابدأ بوضع الفأر في وضع ضعيف ، وتعقيم البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بعمل شق في البطن في خط الوسط عبر الجلد والصفاق من العانة إلى القفص الصدري لفتح التجويف البريتوني وتحديد موقع الأعور والوصلة اللفائفية.
قم بعمل قطع بعيد قدر الإمكان ، عند التقاطع لفصل الأمعاء الدقيقة عن الأعور ، وقطع المساريق بالمقص لإزالة الأمعاء الدقيقة بأكملها بعناية حتى العضلة العاصرة البوابية.
قص الوصلة بين البواب والاثني عشر لفصل الأمعاء الدقيقة تماما عن تجويف البطن ، ووضع الأمعاء الدقيقة المعزولة في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار تحتوي على وسط RPMI بارد ، مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ أو FBS على الجليد. بعد ذلك ، حرك الأنسجة برفق يدويا حتى تغمر جميع الأجزاء في الوسط البارد.
عندما يتم حصاد الأمعاء بالكامل، استخدم الملقط لالتقاط الدهون المساريقية في إحدى حواف الأمعاء ووضع العينة — الجانب المساريقي لأسفل — على منشفة ورقية. بلل الجزء المعوي بالكامل باستخدام RPMI بالإضافة إلى 10٪ FBS لتجنب جفاف الأنسجة والالتصاق ، وحدد موقع بقع Peyer ، والتي تظهر على شكل مجاميع بيضاء متعددة الفصوص ذات شكل يشبه القرنبيط على الجانب المضاد للمساريقي من جدار الأمعاء.
لحصاد بقع باير ، استخدم مقصا جراحيا منحنيا بحيث يكون المنحنى متجها لأعلى لاستئصال كل رقعة برفق من حدودها البعيدة والقريبة ، مع الحرص على استبعاد أنسجة الأمعاء المحيطة ، ووضع بقع باير في آبار فردية من صفيحة مكونة من 12 بئرا تحتوي على RPMI مثلج بالإضافة إلى 10٪ FBS ، على الجليد ، أثناء جمعها.
عندما يتم الحصول على جميع البقع ، استخدم المقص لقطع طرف طرف ماصة دقيقة سعة 1 مليلتر بحيث يكون القطر كبيرا بما يكفي لشفط بقع باير الفردية ، ونقل بقع باير إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 150 مليلتر لكل فأر ، يحتوي على 25 مل من 37 درجة مئوية RPMI بالإضافة إلى 10٪ FBS.
بعد ذلك ، ضع الأنابيب في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية مع تحريك مستمر عند 125 إلى 150 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. في نهاية التحريض ، انقل بقع باير إلى مصفاة خلية 140 ميكرومتر لكل فأر ، واستخدم الطرف المطاطي لمكبس حقنة 110 مليلتر لكل لتعطيل بقع باير برفق من خلال الشبكة إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 50 مل.
اشطف المصافي ب 15 إلى 20 مل من RPMI البارد بالإضافة إلى 10٪ FBS ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من المادة الطافية بعناية ، أعد تعليق الخلايا عند حوالي 1 × 107 خلايا لكل مليلتر من RPMI بالإضافة إلى تركيز FBS 10٪ للعد. بعد ذلك ، قم بنقل 2 إلى 2.5 × 106 خلايا لكل 200 ميكرو لتر من الوسط ، إلى كل بئر من صفيحة سفلية مستديرة مكونة من 96 بئرا ، وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
نظرة عامة
يفصل هذا المقال عملية عزل الخلايا اللمفاوية من لويحات باير (Peyer's patches) في الأمعاء الدقيقة للفئران. تتضمن هذه العملية تشريحاً دقيقاً ومعالجة لأنسجة الأمعاء للحصول على معلق خلوي حيوي لإجراء مزيد من التحليلات.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
- علوم الأعصاب
خلفية علمية
- تعدّ لويحات باير (Peyer's patches) أنسجة لمفاوية منظمة بالغة الأهمية للاستجابة المناعية.
- تحتوي هذه اللويحات على خلايا مناعية متنوعة، بما في ذلك الخلايا اللمفاوية B و T.
- يُعد عزل هذه الخلايا أمراً أساسياً لدراسة الوظائف المناعية.
- تتطلب المنهجية تقنيات جراحية دقيقة لتجنب التلوث.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول مفصل لعزل الخلايا اللمفاوية من لويحات باير في الفأر.
- تعزيز استعادة الخلايا اللمفاوية الحية لأغراض البحث العلمي.
- تسهيل الدراسات المستقبلية حول الاستجابات المناعية في الأمعاء.
الطرق المستخدمة
- قتل الفأر الرحيم وإجراء شق جراحي في خط منتصف البطن.
- تشريح الأمعاء الدقيقة وتحديد بقع باير (Peyer's patches).
- استخدام الرج لفصل الخلايا عن البقع.
- الترشيح والطرد المركزي للحصول على معلق من الخلايا المفردة.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للخلايا اللمفاوية من لويحات باير.
- تحسين معدلات استعادة الخلايا الحية من خلال تقنيات محسنة.
- تأسيس بروتوكول قابل للتكرار للدراسات المستقبلية.
الاستنتاجات
- تعتبر الطريقة الموصوفة فعالة لعزل الخلايا اللمفاوية من لويحات باير (PPs).
- يمكن لهذا البروتوكول أن يساعد في فهم مناعة الأمعاء.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية دراسات حول الاستجابات المناعية والعلاجات.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح عزل الخلايا اللمفاوية من لويحات باير (Peyer's patches) في الفئران تقليل المخاطر الميكانيكية للأهداف الخاصة بالأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالأمعاء (GALT) في مجالي علم المناعة وتطوير لقاحات الغشاء المخاطي. يدعم هذا البروتوكول التحقق من صحة الأهداف من خلال توفير مصدر قابل للتكرار من الخلايا اللمفاوية الأولية B وT لإجراء المقايسات الوظيفية، مما يقلل من الغموض البيولوجي في مراحل الاكتشاف المبكرة. وتعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية من خلال ضمان الحصول على معلقات خلوية حيوية وخالية من التلوث للتحليلات اللاحقة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تمكن من استقصاء الفرضيات العلاجية في مناعة الأمعاء من خلال عزل الخلايا اللمفاوية من الأنسجة اللمفاوية المنظمة.
- القيمة التشغيلية: توفر سير عمل موحد لتفكيك الأنسجة يعمل على تحسين استعادة الخلايا اللمفاوية وحيويتها.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم تقليل مخاطر الأهداف من خلال التحقق الوظيفي من استجابات الخلايا المناعية في نظام ذي صلة بالمرض.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد معلقات من الخلايا اللمفاوية أحادية الخلية المناسبة لقياس التدفق الخلوي، وتحديد ملامح السيتوكين، ومقايسات الفحص الوظيفي.
- القيمة التشغيلية: استخدام الترشيح والطرد المركزي بدرجة حرارة منخفضة للحفاظ على استقرار الخلايا وضمان تكرارية المقايسة.
- القيمة الاستراتيجية: تمكين التحضير القابل للتطوير للخلايا المناعية الأولية من أجل الفحص عالي المحتوى ومواءمة المؤشرات الحيوية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يدعم نمذجة الاستجابات المناعية المخاطية ذات الصلة بالأمراض من خلال توفير الخلايا اللمفاوية الأولية من لويحات باير (Peyer's patches).
- القيمة التشغيلية: يؤسس لسير عمل مستمر بدءاً من حصاد الأنسجة وصولاً إلى المعلق الخلوي لاستخدامه في دراسات التحقق قبل السريرية.
- القيمة الاستراتيجية: يسهل اتخاذ قرارات التطوير المعدلة حسب المخاطر من خلال تمكين القراءات الميكانيكية في التعديل المناعي الذي يستهدف الأمعاء.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يتكامل بروتوكول عزل الخلايا اللمفاوية ضمن سلسلة الاكتشاف المستمرة، بدءاً من تحديد الهدف وصولاً إلى التحقق قبل السريري، مما يدعم مسارات تطوير الأدوية التي تستهدف الجهاز المناعي.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات في الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالأمعاء من خلال توفير خلايا مناعية أولية.
- الفحص: يوفر معلقات لمفاوية جاهزة للمقايسة مع إنتاجيات محددة كمياً لتقييم المركبات أو المحفزات بشكل قابل للتكرار.
- التحليلات: يتيح قياسات كمية للمتغيرات التابعة مثل عدد الخلايا، والحيوية، وتوزيع المجموعات الفرعية لإجراء التحليل المقارن.
- الأبحاث الانتقالية: يربط مرحلة الاكتشاف بالاستمرارية قبل السريرية من خلال استخدام الخلايا اللمفاوية الأولية في المقايسات المناعية الوظيفية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لمنصة قابلة لإعادة الاستخدام لتفكيك الأنسجة، تكون قابلة للتطبيق في مشاريع المناعة وعلاجات الأغشية المخاطية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال استخدام الخلايا اللمفاوية الأولية المستمدة من نسيج لمفاوي ذي صلة فسيولوجياً.
- القيمة التشغيلية: تحقيق التقييس وقابلية التكرار عبر خطوات محددة من التشريح والرج والترشيح والطرد المركزي.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في برامج علم المناعة المبكرة.
- تأثير المحفظة: تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للمعدلات المناعية التي تستهدف الأمعاء بناءً على وظيفة الخلايا اللمفاوية التي تم التحقق منها.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تشريح الفئران والتشريح المعقم للأنسجة لعزل بقع باير دون حدوث تلوث.
- يعتمد على جهاز هز مداري، ومصافٍ خلوية، ومعدات طرد مركزي يتم الحفاظ عليها في درجات حرارة مضبوطة.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق البحثية فيما يخص التعامل مع الأنسجة، ومدة الرج، وبروتوكولات إعادة تعليق الخلايا.
- تشمل اعتبارات التكييف اختيار حجم الشبكة وتكوين الوسط المخصص لسلالات الفئران المختلفة أو حالات الأنسجة المتنوعة.
- تشمل القيود العملية تباين إنتاجية الأنسجة والحاجة إلى المعالجة الفورية للحفاظ على حيوية الخلايا اللمفاوية.
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
ورم انجرافتمينت في نموذج الفأر إكسينوجرافت من عباءة البشرية الخلية اللمفاوية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عزل خلايا CD4 + T من الغدد الليمفاوية باستخدام الماوس Miltenyi MACS تنقية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عزل الخلايا اللمفاوية من المسالك التناسلية الماوس الغشاء المخاطي
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
العزلة وتدفق Cytometric توصيف الفئران الصغيرة المعوية اللمفاويات
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
كشف اللاعبين الرئيسيين من الحصانة Humoral: متقدم ومحسن اللمفاويات العزلة البروتوكول من بقع الفاري بير في
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تحليل Hypermutation الجسدية في intron JH4 من الخلايا B مركز الجرثومية من بقع باير ماوس
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 29 أغسطس 2026