التوليد في المختبر للخلايا المتغصنة البلازمية من الأسلاف اللمفاوية الشائعة

الخلايا المتغصنة البلازماسيتيويدية ، أو pDCs ، هي خلايا مناعية تستجيب للعدوى عن طريق إنتاج إنترفيرون السيتوكين من النوع الأول.

لتوليد pDCs في المختبر ، خذ تعليقا من الخلايا السلفية اللمفاوية الشائعة ، أو CLPs ، المعزولة من نخاع عظم الفأر. يمكن أن تتمايز CLPs إلى خلايا ليمفاوية وخلايا غصنية.

أضف معلق الخلية فوق طبقة من الخلايا المغذية — الخلايا اللحمية الملتصقة — المشعة بأشعة جاما لمنع التكاثر. توفر الخلايا المغذية السيتوكينات والتلامس الخلوي المطلوب لتمايز CLPs.

أضف تركيزا مناسبا من التيروزين كيناز 3 ليجند الشبيه ب FMS ، أو FL - سيتوكين ثنائي التكافؤ يعزز تطور pDC - واحتضانه.

تهاجر CLPs بين الخلايا المغذية وتتكاثر لتشكيل مجموعات من الخلايا ، تسمى المناطق المرصوفة بالحصى.

يرتبط FL الموجود في الوسط بمستقبل Flt3 - مستقبل التيروزين كيناز - على CLPs. يؤدي الارتباط إلى إزدخار المستقبلات والفسفرة الذاتية لبقايا التيروزين في المجال السيتوبلازمي.

ترتبط بروتينات المحول السيتوبلازمي بهذه المخلفات وتصبح فسفرة ، مما يؤدي إلى نقل الإشارة إلى مكونات الإشارات النهائية. يتسبب تسلسل الإشارات في تمايز CLPs إلى pDCs - خلايا مستديرة صغيرة تنمو في معلق - بالإضافة إلى الخلايا المتغصنة التقليدية ، أو cDCs - خلايا ملتصقة أكبر على شكل مغزل.

اجمع الخلايا. أضف أجساما مضادة ضد علامات السطح الخاصة ب pDC- و cDC. تحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي.

الخلايا الإيجابية للعلامات الخاصة ب pDC والسلبية للعلامات الخاصة ب cDC إلى تطور pDC ناجح.

لتحليل الأسلاف اللمفاوية الشائعة ، أو CLPs ، عن طريق قياس التدفق الخلوي ، بعد ذلك ، يقوم F_c بحظر الخلايا باستخدام مضاد CD16 / 32 لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، متبوعا بالتلوين المتزامن للخلايا بكوكتيل الجسم المضاد المناسب.

بعد 15 دقيقة على الثلج ، اغسل الخلايا في ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت FACS ، وأعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من محلول FACS الجديد. بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر ، وفرز الخلايا على الفور على مقياس التدفق الخلوي باستخدام المرشحات والفولتية المناسبة ، وجمع الخلايا ذات الأهمية في أنبوب 15 مليلتر يحتوي على 8 ملليلتر من RPMI الكامل.

لتوليد مجموعة من pDC عالية الإخصاء ، من الضروري فرز المجموعة الصحيحة من CLPs من خلايا نخاع العظم المحصودة للزراعة المختبرية باستخدام نظام التغذية AC-6.

في نهاية الفرز ، قم بتدوير الخلايا ، وأعد تعليق حبيبات خلية CLP مع ما يكفي من RPMI الكامل للحصول على كثافة خلية تبلغ حوالي 5 أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بزرع 500 خلية لكل بئر في الصفيحة المكونة من 12 بئرا التي تحتوي على خلايا التغذية AC-6 ، واستكمل الثقافات المشتركة ب 100 نانوجرام لكل مليلتر FLT3 ligand. بعد ذلك ، قم باحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع المراقبة البصرية الدورية للخلية المتغصنة ، أو تطور التيار المستمر ، تحت المجهر.

في اليوم 12 ، قم بحصاد الخلايا الموجودة في المادة الطافية للزراعة المشتركة ، واغسل كل بئر مرة واحدة بنصف ملليلتر من وسط RPMI الكامل ، مع تجميع المواد الطفية الناتجة والغسل. ثم أضف نصف ملليلتر من الوسط الطازج إلى كل بئر ، واستخدم مكشطة خلية لفصل الخلايا الملتصقة. اجمع بين الخلايا المنفصلة والخلايا العائمة ، وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية الناتج ، وأعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت FACS.

بعد ذلك ، قم بحساب الخلايا وصخها لتعبير CD11c و CD11b و B220 بعد حظر F_c ، كما هو موضح للتو. يمكن بعد ذلك تحليل الخلايا المستزرعة المشتركة لوجود مجموعات CD11c التقليدية الإيجابية ، وإيجابية CD11b ، وسلبية B220 ، والبلازما سيتويد CD11c إيجابية ، وسلبية CD11b ، وسلبية B220 DC.