إعادة إعماره البيوكيميائية من مستقبلات البروتين الستيرويد • المجمعات Hsp90 وإعادة تنشيط يجند تجليد

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعادة تكوين مجمع بروتيني من مستقبِل стيرويدي وHSB 90 كيميائيًا حيويًا، وإعادة تنشيط نشاط ارتباط ربيطة المستقبِل الستيرويدي، وهو ما يمكن استخدامه لاختبار متطلبات العامل المساعد HSB 90 وتأثيرات إضافة مركبات خارجية إلى عملية إعادة التكوين. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير سيتوزول خلوي يحتوي على مستقبِلات جلوكوكورتيكويد وظيفية. بعد ذلك، يتم امتصاص GR مناعيًا من السيتوزول الخلوي والداخلي.

يتم فصل HSP 90. ثم يُعاد تكوين المعقد الهجين GR HSP 90 باستخدام مصدر خارجي من HSP 90 وبروتينات مرافقات أخرى وعوامل مساعدة. وأخيراً، يتم تحليل معقدات البروتين المعاد تكوينها ونشاط ارتباط اللجين؛ وتحديداً تُستخدم طرق مثل SDS page، وwestern blotting، ومقايسات ارتباط اللجين المشع لإظهار تكوين المعقد الهجين GR HSP 90 ونشاط ارتباط الستيرويد.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المرافقات الجزيئية HSP 90، مثل تحديد المرافقات المساعدة ومرافقات COS المطلوبة لتسهيل النشاط الوظيفي لـ HSP 90. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول طي البروتين، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل تطوير المركبات الرائدة المعتمدة على HSP 90 وتحليل مسارات الإشارات داخل الخلايا التي تتطلب HSP 90. ستقوم هانا فرانكلين وناثان فور أوا، وهما طالبان تخرجا مؤخراً من مختبري، باستعراض الإجراء. لعزل مستقبلات القشرانيات السكرية الوظيفية أو GR، يتم تنمية خلايا ليفية فئرانية L 9 29 أو خلايا SF nine التي تم حقنها بفيروس باكو GR مأشوب وهي في مرحلة النمو الأسي. يتم إجراء طرد مركزي للمعلق الخلوي عند 5,000 Gs لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

يجب أن يكون حجم الراسب الناتج حوالي واحد إلى خمسة ملليلتر. اغسل راسب الخلايا ثلاث مرات باستخدام 15 ملليلتر من محلول هانكس الملحي الموّزن. قم بتحضير 1.5 حجم من محلول التجانُس الذي يحتوي على HEM buffer وواحد millimolar من phenyl methyl syl fluoride أو PMSF وثلاثة أقراص كاملة من مثبط البروتياز الصغير (mini protease inhibitor) المطحونة باستخدام 50 ضربة من الهاون.

استخدم جهاز التجانس لتمزيق الخلايا، مع تنفيذ هذه الخطوة على الثلج لمنع تحلل البروتينات. يتم إجراء طرد مركزي فائق للمجانس عند 100,000 Gs لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. تُقسم supernatant التي تحتوي على السيتوسول إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل، بمقدار 500 µL لكل أنبوب، وتُخزن عند درجة حرارة -20 °C.

لتحضير خليط يحتوي على جسم مضاد أحادي النسيلة من نوع IgG مُعد ضد المستقبل GR النوعي، اخلط 100 microliters من السيتوسول المذاب الذي يحتوي على GR، و200 microliters من منظم TEGM، و100 microliters من معلق PAS أو protein A-sepharose بتركيز 20%، وخمسة micrograms من جسم مضاد أحادي النسيلة anti-G من نوع IgG مثل bugger two. وذلك نظراً للحجم الكبير نسبياً لكرات PAS.

استخدم رأس ماصة P 200 مقطوعاً لنقل الـ PAS من الملاط بتركيز 20% إلى أنابيب العينات. ضع العينات على عجلة دوارة رأسية وحضنها لمدة ساعتين على الأقل مع الدوران المستمر. بعد ذلك، قم بإزالة البروتينات غير المرتبطة من كريات الـ PAS للأجسام المضادة عن طريق تدوير العينات في جهاز طرد مركزي مبرد لمدة دقيقة واحدة.

عند 10,000 Gs، اغسل الراسب مرتين عن طريق إضافة ملليلتر واحد من TEGM buffer مع الرج باستخدام جهاز vortex، ثم الطرد المركزي. أزل غسلة الشطف النهائية باستخدام رأس ماصة P 200 مجعد لفصل HSB 90 داخلي المنشأ عن راسب GR المناعي، وأضف 355 microliters من TEG buffer و 45 microliters من sodium chloride بتركيز five molar إلى الجسم المضاد. راسب PAS الذي تم تحضيره مسبقاً.

ضع العينات على عجلة دوارة رأسية واتركها لتحضن لمدة ساعة ونصف مع الدوران المستمر. تخلص من البروتينات غير المرتبطة من الراسب المناعي عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 10,000 Gs. اغسل الرواسب مرة واحدة باستخدام 1 ml من منظم TEG ومرة واحدة باستخدام 1 ml من منظم HEPES بتركيز 10 millimolar وبدرجة pH 7.4. وباستخدام رأس ماصة P 200 مقصوص الطرف، قم بإزالة سائل الغسيل مع الحرص على عدم تحريك الراسب.

لإعادة تشكيل المعقد غير المتجانس GR HSB 90، أضف إلى الراسب مزيجاً يحتوي على 50 µL من مصدر للمرافقات الجزيئية، مثل مستخلص خلايا الشبكية للأرانب، و 5 µL من نظام توليد ATP. وتعد هذه الخطوة التالية بالغة الأهمية لضمان الخلط الكافي للراسب ومحلول إعادة التشكيل. يتم تحضين العينات في حمام مائي عند درجة حرارة 30 °C لمدة 20 دقيقة بالضبط.

قم بنقر الأنابيب كل دقيقة إلى دقيقتين من أجل تحريك الراسب بلطف وخلط محلول إعادة التكوين. أضف 1 mL من منظم TEGM، ثم استخدم جهاز المرج (vortex) وافصل بالتوجيه المركزي عند 10,000 Gs لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة الطافي مع الحرص على عدم تحريك الراسب.

كرر عملية الغسل مرتين إضافيتين لتحديد البروتينات الموجودة في الراسب المعاد تكوينه. جهز العينات للفصل الكهربائي بإضافة 50 µL من منظم عينات SDS page الذي يحتوي على betta mercaptoethanol. اخلط العينات جيداً ثم حضنها لمدة خمس دقائق في حمام مائي مغلي أو في كتلة تسخين إلكترونية عند درجة حرارة 100 °C.

قم بطرد العينات مركزياً عند 10,000 Gs لمدة دقيقة واحدة. استخدم السائل الطافي من هذه العينات لإجراء الفصل الكهربائي باستخدام SDS page أو الفصل الكهربائي ميكروفلويديك (microfluidic electrophoresis) متبوعاً بتحليل ويسترن بلوت (western blot). إن استخدام رأس ماصة P 200 مجعد لتحميل السائل الطافي سيحد من سحب الراسب عن طريق الخطأ.

تتمثل الخطوة التالية في تحليل مركب بروتين GR HSP 90 لقياس نشاط الارتباط بالستيرويد. باستخدام ستيرويد مشع بالتريتيوم، ابدأ بإضافة 47.5 µL من محلول HEM المنظم و 2.5 µL من ديكساميثازون مشع بالتريتيوم بتركيز 2 µM إلى الراسب المناعي المعاد تشكيله.

امزج الراسب بلطف مع الحرص على تقليل كمية العينة الملتصقة بجدار أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق. حضن العينة طوال الليل دون تحريك على الثلج. أضف 1 mL من محلول TEGM المنظم، ثم امزجه بلطف وقم بإجراء الطرد المركزي عند 10,000 g لمدة دقيقة واحدة.

تخلص من السائل الطافي بعناية، حيث إنه يحتوي على الستيرويد المسمى بالتريتيوم غير المرتبط، وكرر عملية الغسل ثلاث مرات إجمالاً باستخدام محلول TEGM المنظم بشكل كامل. قم بإزالة كامل السائل الطافي عند الانتهاء من الغسلة الأخيرة.

باستخدام طرف ماصة P 200 مُقرمش. يتم تعليق كريات المناعة المغسولة في 200 µL من محلول TEGM المنظم ونقلها إلى زجاجات وميضية سعة 10 mL.

أضف 4.8 milliliters من كوكتيل الوميض (scintillation cocktail) إلى الأنابيب ثم قم برجّها باستخدام جهاز الفورتيكس (vortex). وأخيرًا، أجرِ قياس الطيف الوميضي السائل (liquid scintillation spectrometry)؛ وتظهر هنا بيانات SDS page واللطخة الغربية (western blot) التمثيلية في هلام صبغة كوماسي (kumasi stain gel). يتم امتصاص المعقد غير المتجانس GR HSB 90 الداخلي مناعيًا من سيتوسول الخلية باستخدام أجسام مضادة لـ GR، ويتم إظهار البروتينات الفردية التي تم امتصاصها مع GR.

فيما يلي بيانات الفصل الكهربائي للموائع الدقيقة من Experian والتي تمثل معقدات GR HSP 90 غير المتجانسة المعاد تشكيلها. وقد تم تأكيد خصوصية الامتصاص المناعي لـ GR عن طريق استبدال الجسم المضاد الممتص لـ GR بجسم مضاد غير مناعي، حتى عند استخدام كميات مفرطة. لا يتم ترسيب GR أو المرافقات الجزيئية مناعيًا.

وبالمثل، يمكن تأكيد انفصال HSP 90 وبروتينات المرافقة الأخرى عن مستقبل الجلوكوكورتيكويد (GR) المجرد من الملح عن طريق تحليل لطخة ويسترن للرواسب المناعية المجردة والمعاد تشكيلها. يمكن الكشف عن السلسلة الثقيلة للأجسام المضادة الممتصة مناعيًا باستخدام صبغة كوماسي وتحليل لطخة ويسترن، وهو ما يؤكد ظهور رواسب مناعية متساوية الحجم في كل مسار. تُعرض هنا بيانات تمثيلية لنشاط ربط الستيرويد لمستقبل GR الممتص مناعيًا باستخدام إما محلل الخلايا الشبكية أو البروتينات المنقاة.

عادةً ما تعود قدرة ارتباط الستيرويد في معقد GR HSB 90 غير المتجانس المعاد تشكيله إلى 75 إلى 100% من مستوى نشاط ارتباط GR HSB 90 الداخلي. وكما هو الحال في بيانات الرحلان الكهربائي، يمكن استخدام جسم مضاد غير مناعي بدلاً من الجسم المضاد لـ GR كضابط سلبي ولقياس الارتباط غير النوعي للستيرويد المسمى بالتريتيوم. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد (2D gel electrophoresis) للإجابة على تساؤلات إضافية، مثل تأثير تعديلات ما بعد الترجمة لـ HSP 90 على إعادة تشكيل المعقد غير المتجانس وارتباط الستيرويد. لقد أتاحت مقاييس إعادة التشكيل، مثل تلك الموضحة هنا، للباحثين استكشاف الأهمية الوظيفية لآلية المرافقات MultiPro المعتمدة على HSP 90 و HSP 70 وتجميعها التدريجي باستخدام مستقبل الغلوكوكورتيكويد كبروتين عميل نموذجي لـ HSP 90.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحضير معقدات بروتين مستقبل الجلوكوكورتيكويد (glucocorticoid receptor) وHSP 90 الوظيفية من بروتينات منقاة في نواتج تحلل الخلايا. تشمل الخطوات المستخدمة تحضير نواتج تحلل الخلايا التي تحتوي على GR، والامتزاز المناعي للمستقبل، وإزالة البروتينات الداخلية باستخدام الملح (salt stripping)، وإعادة تكوين المعقد المتباين باستخدام HSP 90 الخارجي، والعوامل المساعدة HSP 70، والمرافقات البروتينية المساعدة (cos chaperones).