آلية التفاعل اللوني مسعور اختيار عمود للاستخدام في تنقية البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو اختيار عمود كروماتوغرافيا سائلة مثالي من نوع HI باستخدام طريقة استكشافية مؤتمتة لتنقية بروتين مأشوب باستخدام نظام BioRad DUO flow للكروماتوغرافيا السائلة ذات الضغط المتوسط. يتم تحقيق ذلك من خلال تحضير المحاليل المنظمة اللازمة والمحللات البكتيرية التي تحتوي على البروتين المأشوب المستهدف أولاً. بعد ذلك، يتم إعداد نظام duo flow للكروماتوغرافيا مادياً وتوصيل أنابيبه وتجهيزه لبروتوكول الاستكشاف.

بعد ذلك، يتم تحميل العينات وتشغيل طريقة استكشاف عمود الـ HI المبرمجة لجمع عينات شريحة وقت الخروج (EIT). وفي النهاية، يتم تحليل الـ EIT وتحديد عمود الـ HI والوسط الأمثل بناءً على خصائص الفصل الملحوظة. وفي الختام، يمكن الحصول على نتائج توضح وسط عمود الـ HI المفضل لتوسيع نطاق تنقية البروتين المستهدف للباحث من خلال كروماتوغرافيا السوائل ذات الضغط المتوسط باستخدام إمكانيات استكشاف عمود الـ HI الآلية بنظام DUO flow.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل عمليات التشغيل المتتالية لكروماتوغرافيا العمود اليدوية، في أن أتمتة العملية تقلل من التباين وتضمن الحصول على نتائج عالية القابلية للتكرار. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات بسبب التعقيد المادي لأنظمة الكروماتوغرافيا السائلة الحديثة، ومع ذلك، يمكن إتقان هذه العملية بسهولة.

بعد ممارسة كافية، سيقوم كل من أورانج ستون وشيلي أندرسون، وهما طالبان من مختبري، باستعراض الإجراء. للبدء، قم بتحضير 500 milliliters من المحاليل المنظمة التالية: 200 millimolar sodium phosphate للمحلول المنظم A1، و200 millimolar sodium hydrogen phosphate للمحلول المنظم A2، و4.8 molar ammonium sulfate للمحلول المنظم B2، بينما سيعمل deionized water كمحلول منظم B1. قم بإزالة الغازات من المحاليل المنظمة لضمان ظروف تشغيل كروماتوغرافية مثالية. سيقوم نظام maximizer بخلط المحلولين المنظمين A1 وA2 لإنتاج محلول شطف فوسفاتي منخفض الملوحة، كما سيقوم بخلط المحلولين المنظمين B1 وB2 لإنتاج محلول كبريتات الأمونيوم عالي الملوحة.

المحلول المنظم للبدء. قم بتحضير 20 ملي لتر من العينة المراد تحميلها عن طريق خلط 10 ملي لتر من محلول تحلل الخلايا الذي يحتوي على البروتين المراد تنقيته مع 10 ملي لتر من المحلول المنظم B2. يجب أن يكون التركيز النهائي لكبريتات الأمونيوم في محلول عينة تحلل الخلايا حوالي 2.4 molar، مما يجعله مكافئاً تقريباً للمحلول المنظم للبدء.

قم بترشيح خليط منظم التحلل باستخدام مرشح سرنجة بمسامية 0.45 ميكرومتر ومنخفض الارتباط بالبروتين لإزالة المواد الجسيمية من المحلول. احتفظ بالعينة على الثلج حتى تصبح جاهزة للتحميل في النظام. يعد الإعداد المادي وتوصيلات السباكة لنظام الكروماتوغرافيا أحد أكثر الجوانب تعقيداً في هذا الإجراء.

قم بإعداد نظام كروماتوغرافيا التدفق المزدوج (duo flow chromatography) وفقاً للمخطط الموضح هنا. تأكد من توفر أحجام كافية من المحلول المنظم لكامل البروتوكول وضمان بقاء الأنابيب مغمورة باستمرار. قم بتوصيل صمام تحميل العينة وحلقة العينة الديناميكية كما هو موضح هنا، ثم صل حلقة العينة بمدخل صمام العينة عند الموضع ثلاثة.

قم بتجهيز ثمانية أزواج متماثلة الحجم من أنابيب PEEK بقطر خارجي يبلغ 1/16 بوصة. ثم قم بتوصيل هذه الأزواج بالمواضع من واحد إلى ثمانية في صمامي اختيار الأعمدة. بعد تشغيل مصابيح كاشف UV والتأكد من معايرة جميع الكواشف، قم بتركيب صمام تقسيم التدفق ووحدة التحكم في التقسيم الخاصة بجامع الكسور كما هو موضح هنا.

يتم تشغيل صمام تقسيم مجمع الكسور في الموضع الثاني ووحدة التحكم في التقسيم بشكل منفصل عن محطة عمل الكروماتوغرافيا. اضبط نسبة التقسيم على 10%. استبدل رأس التقطير القياسي لمجمع الكسور في الموضع الثاني برأس تقطير مخصص للأطباق الدقيقة.

اشطف حلقة العينة وقم بتطهير نظام الكروماتوغرافيا. بعد ذلك، ابدأ تدفقًا يدويًا لمحلول الاستخلاص المنظم (evolution buffer) عبر النظام بمعدل 1 mL/min. قم بتوصيل أعمدة HI high trap سعة 1 mL بالمواقع من الثاني إلى الثامن في صمامات اختيار الأعمدة.

قم بإزالة الوصلة التي تربط صمامات اختيار الأعمدة في الموضع الثاني. قم بتوصيل وصلات العمود الموجودة في المنبع بـ duo flow. قم بتمرير محلول الشطف المنقي (elucian buffer) عبر الوصلات حتى يتم طرد كل الهواء وتكون هناك قطرة كبيرة من محلول الشطف.

بعد ذلك، قم بإزالة السدادة المتصلة بمدخل العمود وضع قطرة كبيرة من محلول منظم منخفض الملوحة على الجزء العلوي من العمود. ثم قم بتوصيل العمود بالوصلات العلوية. قم بتوصيل المخرج بوصلات العمود السفلية وأنابيب صمام الاختيار.

اضبط حد الضغط العكسي على 40 PS.I واغسل العمود بخمسة أحجام من العمود من منظم الاستخلاص بمعدل تدفق قدره 1 mL/min. اغسل العمود بـ 10 أحجام من العمود من منظم البدء بمعدل تدفق قدره 1 mL/min.

بمجرد استقرار تتبع pH وUV والضغط الخلفي، قم بتحويل صمامات اختيار العمود يدويًا إلى الوضع الأول وأوقف تدفق المنظم. لتحميل العينة، اغمر أنبوب مدخل العينة في العينة التي حجمها 20 milliliter. ثم قم بتحويل صمام غسل تحميل حلقة العينة إلى الوضع الأول وصمام تحميل العينة إلى وضع التطهير.

قم بتشغيل مضخة تحميل حلقة العينة، لسحب العينة إلى أنابيب المضخة بمعدل تدفق 1 mL/min حتى وصول العينة مباشرة إلى صمام تحميل العينة. قم بتحويل صمام تحميل العينة من وضع التطهير (purge) إلى وضع التحميل (load). أعد تشغيل مضخة تحميل حلقة العينة بمعدل تدفق 1 mL/min حتى يتم سحب 10 mL من العينة في حلقة العينة الديناميكية من نافذة الإعداد في برنامج biologic.

حدد أجهزة النظام المميزة بنجمة في هذا الجدول. بعد ذلك، اختر ستة أعمدة HIC لبرنامج المقايسة. يبدأ تدرج ملحي خطي تنازلي وطريقة استكشاف لستة أعمدة تدفق محلول البدء يدوياً بمعدل 1 mL/min.

اضغط على زر البدء في وحدة التحكم في الموزع لبدء عملية تقسيم التدفق بنسبة 90% إلى 10% EIT، ومباشرة بعد بدء تشغيل طريقة البرنامج، اضغط على زر البدء في لوحة التحكم التي تظهر على الشاشة لجهاز جمع الكسور الخاص بصفيحة 96 بئرًا غير المتصلة. راقب العرض في الوقت الفعلي للتأكد من معلمات التشغيل المتوقعة. قارن تتبع الامتصاص الخاص بـ GFP عند 397 nanometer بتتبع الامتصاص العام للبروتين عند 280 nanometer لتقدير الفصل والتنقية النسبية باستخدام أوساط HI المختلفة التي يتم استكشافها؛ ويمكن نقل أجزاء تتراوح من 5 إلى 50 µL من كسور صفيحة 96 بئرًا إلى صفيحة جديدة وفحص محتوى البروتين النوعي بواسطة Eliza أو Western blot ومحتوى البروتين الكلي باستخدام SDS page أو نظام Experian للفصل الكهربائي الموائع الدقيقة. تظهر هنا الموصلية الكهربائية لمتدرج ملح hick وضغط العمود الممثلين لعمليات الاستكشاف.

يعد التغير في تركيز الملح، كما يتم قياسه من خلال النسبة المئوية للمحلول المنظم المسحوب من خطوط المحلول المنظم عالي الملوحة، أمراً نموذجياً في منهجية HI. ومع انخفاض تركيز الملح، تخرج البروتينات المرتبطة بالعمود وفقاً للموصلية، وهو ما يتوافق مع تركيز الملح المرصود، حيث يتم قياس تركيز الملح في الخط الذي يلي مباشرة كاشفات quad tech وUV. ويشير الإزاحة بين تتبع تدرج الملح وتتبع الموصلية إلى الوقت اللازم لانتقال المحلول المنظم من مدخل المحلول المنظم عبر النظام وصولاً إلى مراقب الموصلية.

يظل ضغط النظام وpH ثابتين نسبياً طوال فترة تشغيل العينة. يوضح هذا الشكل الكروماتوغرامات الخاصة بعمليات استكشاف متتالية لعمود HI مع الكشف المباشر عن إجمالي البروتين. يتم إنجاز NGFP عن طريق قياس امتصاص الضوء عند 280 nanometers و 397 nanometers على التوالي.

من الممكن تقدير الوفرة النسبية لبروتين GFP والفصل لكل عملية استكشاف. ومن خلال مقارنة الخطين في هذا الشكل، تم تصور أنابيب استنبات الكسور 10 و 12 و 14 و 16 و 18 من عملية استكشاف الشمر FF تحت ضوء الغرفة المحيط أو الفلوري، كما تم فحص أنابيب الأشعة فوق البنفسجية من الأمام ومن الأعلى لملاحظة طيف انبعاث GFP المميز، حيث تم اكتشاف GFP بوضوح في الكسر 14. وفي كلتا صورتي الأشعة فوق البنفسجية، فإن اللون الأزرق المنتشر في اللوحة اليسرى للأشعة فوق البنفسجية هو الضوء المنبعث من مصباح الأشعة فوق البنفسجية.

تتوافق بيانات ما بعد التشغيل هذه بشكل جيد مع الكشف المباشر عن GFP عن طريق قياس امتصاص السائل النازل عند 397 نانومتر، وهو ما يحدد أيضاً أن الجزء 14 يحتوي على الذروة الرئيسية لبروتين GFP الذي تم استخلاصه. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل لطخة ويسترن (western blotting)، ومقايسات الإليزا (ELISA)، ومجهر القوة الذرية، ومقايسات إعادة البناء الكيميائية الحيوية للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بنقاء والنشاط الوظيفي للبروتين الذي يتم تنقيته.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحاجة إلى التحكم اليدوي في نظام التدفق المزدوج في نقاط عدة من الطريقة. وتشمل الأمثلة على ذلك إعادة ملء المحلول المنظم وتحميل العينات، والتحقق من وجود فقاعات هوائية، وتشغيل وإيقاف مصابيح الكشف حسب الضرورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نظام الكروماتوغرافيا السائلة لإجراء استطلاع مؤتمت للبحث عن أفضل أعمدة ووسائط HI.

من خلال التحليل التقييمي للنتائج الظاهرة في مخطط الفصل (inline) والملصق (poster)، سيتمكن الباحث من اختيار العمود المناسب لعملية تنقية لاحقة على نطاق أوسع، والتي يمكن دمجها أيضاً مع طرق كروماتوغرافية أخرى لزيادة نقية البروتين المستهدف وحصيلة إنتاجه.