تحديد مثبطات الكيناز التي تعدل استجابة الخلايا الزعترية لإشارات TCR القوية

ابدأ بخلايا الخلايا الزعترية للفئران في طبق متعدد الآبار. أضف حبات مغناطيسية مطلية بالأجسام المضادة ل CD3 و CD28. إلى مجموعة فرعية من الآبار ، أضف تركيزا مناسبا لمثبط كيناز الاختبار. حضن.

ترتبط الأجسام المضادة بمستقبلات CD3 و CD28 على سطح الخلية على الخلايا الغدة الصعترية الإيجابية المزدوجة وتنشطها ، مما يتسبب في تقليل تنظيم مستقبلات الخلايا التائية ، و TCRs ، وتنشيط كيناز بروتين العصارة الخلوية.

كينازات البروتين هذه على تنشيط مسارات الإشارات النهائية ، مما يؤدي إلى زيادة تعبير CD69 على سطح الخلية وتنشيط العصارة الخلوية caspase-3. يشق الكاسباز 3 المنشط البروتينات الخلوية الأساسية — مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا الزعترية.

في الخلايا المعالجة بمثبط الكيناز ، تمنع المثبطات كينازات العصارة الخلوية ، مما يعدل تعبير CD69 وتنشيط كاسباز 3.

الماصة في كوكتيل الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور الذي يرتبط بمستقبلات TCR و CD4 و CD8 المشتركة للخلايا الصعترية ومستقبلات CD69. عالج الخلايا الزعترية بمخزن مؤقت لإصلاحها ونفاذها.

احتضان بجسم مضاد مضاد للكاسباز -3 الموسوم بالفلوروفور يرتبط بالعصارة الخلوية caspase-3. تحليل الخلايا الزعترية باستخدام قياس التدفق الخلوي.

تعبر الخلايا الصعترية الإيجابية المزدوجة عن علامات سطح الخلية الفلورية CD4 و CD8 و CD69 والكاسباز داخل الخلايا -3 وتظهر تنظيم TCR السفلي. في المقابل ، تظهر الخلايا الزعترية المعالجة بالمثبطات مستويات أقل من CD69 الفلوري و caspase-3.

لبدء علاج الخلايا الزعترية بمثبطات الكيناز ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 40 ميكرولترا لكل بئر من الخلايا الزعترية إلى صفيحة صغيرة الحجم. ضع الطبق على الثلج. بعد ذلك ، قم بتقطيع جزء واحد من مثبطات كيناز ، DMSO ، وديكساميثازون ، وأربعة أجزاء من وسائط RPMI الكاملة في صفيحة مكونة من 96 بئرا.

قم بتعيين ثمانية آبار من الصفيحة صغيرة الحجم للضوابط غير المعالجة ، وأربعة آبار للضوابط الإيجابية المعالجة بالديكساميثازون لموت الخلايا ، عن طريق إضافة ديكساميثازون المخفف بتركيز 5 ميكرومولار ، وأربعة آبار إلى الضوابط المعالجة بالمركبات عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من DMSO المخفف. بعد ذلك ، من الآبار المقابلة للوحة المثبطة ، أضف 0.5 ميكرولتر من كل مثبط مخفف إلى اللوحة المكونة من 96 بئرا.

لبدء تحفيز الخلايا الغدة الزعترية ، تأكد أولا من تعليق الخرز المضاد ل CD3 و CD28 بشكل موحد. بعد ذلك ، اغسل 1 مليلتر من الخرزات ب 2 ملليلتر من المخزن المؤقت PBS. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لفصل الخرز عن المادة الطافية ، واستنشاق المحلول. بعد ذلك ، قم بتعليق الخرزات في 1 مليلتر من وسط RPMI الكامل.

أضف 10 ميكرولتر لكل بئر من معلق الخرزة إلى كل عينة معالجة بالمثبط ، والعينات الأربع المعالجة ب DMSO ، وأربع عينات من 8 عينات غير معالجة. أضف 10 ميكرولتر من RPMI الكامل إلى الآبار الأربعة المتبقية غير المعالجة.

استخدم شاكر مداري دقيق لتحريك اللوحة برفق. بعد ذلك ، احتضان الخلايا الزعترية في بيئة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 17 إلى 20 ساعة أو بين عشية وضحاها.

قم بتجهيز غسالة لوحة التدفق الصفحي الآلي ، أولا ، ب 150 مل من محلول الإيثانول توين ، ثم بالماء منزوع الأيونات المكمل بنسبة 1٪ Tween-20 ، وأخيرا ، مع محلول غسيل FACS. في نهاية الحضانة ، باستخدام نظام غسيل الألواح ، اغسل اللوحة باستخدام عازلة غسيل FACS باستخدام دورة غسيل تسع مرات. يضيف كل غسل ويزيل 55 ميكرولترا من محلول الغسيل عن طريق التدفق الرقائقي ، مما يؤدي إلى التخفيف الأسي للكواشف في الآبار.

لتلطيخ المستضدات السطحية ، أولا ، قم بتخفيف وحدة واحدة من الأجسام المضادة المضادة ل CD3 و CD4 و anti-CD8 و Anti-CD69 في 100 وحدة من المخزن المؤقت للغسيل FACS. ثم قم بإعادة تعليق الخلايا في 25 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة للتلطيخ. استخدم شاكر مداري دقيق لتحريك اللوحة برفق ، ثم اترك الطبق على الجليد لمدة 30 دقيقة.

لإصلاح الخلايا ، أولا ، اغسل اللوحة ب 55 ميكرولتر من محلول غسيل FACS باستخدام دورة غسيل تسع مرات كما هو موضح من قبل. ثم أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتثبيت والنفاذية إلى كل بئر. تخلط جيدا وتحتضن الطبق على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإعداد 1x perm / wash buffer عن طريق تخفيف 25 مل من المخزون 10x المقدم في 225 مل من الماء فائق النقاء.

قم بتجهيز غسالة الألواح بمخزن مؤقت 1x ، واغسل اللوحة ب 55 ميكرولترا من المخزن المؤقت 1x باستخدام دورة غسيل تسع مرات كما هو موضح من قبل. امزج 1 مليلتر من الجسم المضاد للكاسباز 3 مع 2 ملليلتر من 1x بيرم وغسل المخزن المؤقت. أضف 25 ميكرولتر لكل بئر من الخليط إلى الخلايا الثابتة.

استخدم شاكر مداري دقيق لتحريك اللوحة برفق. اترك الطبق على الجليد لمدة ساعة. في نهاية الحضانة ، كرر خطوة الغسيل ، تسع مرات باستخدام 1x perm والغسيل المؤقت. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من مخزن غسيل FACS إلى جميع آبار اللوحة ، وقم برفع الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلط المحلول.

أخيرا ، انقل العينات المختلطة إلى أنابيب ميكروتيتر. قم بتعبئة الأنابيب باستخدام المخزن المؤقت للغسيل FACS إلى حجم إجمالي يبلغ 200 ميكرولتر وانتقل إلى تحليل قياس التدفق الخلوي.