تنشيط البلاعم المشتقة من نخاع عظم الفأر استجابة للأجسام المضادة

بعد التعرض لمسببات الأمراض ، تخضع البلاعم للتنشيط وتطلق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات والمضادة للالتهابات ، مما ينسق استجابة الجهاز المناعي.

لدراسة تنشيط البلاعم المشتق من نخاع العظام في المختبر ، انقل معلق خلية نخاع عظم الفأر المعزول إلى قارورة مزرعة. احتضان لفترة وجيزة.

تلتصق الخلايا الوسيطة والخلايا الوحيدة والضامة الناضجة بسطح القارورة بينما تظل أسلاف المكونة للدم معلقة.

اجمع الوسائط التي تحتوي على أسلاف المكونة للدم وأجهزة الطرد المركزي. نقل الخلايا المعلقة في عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، M-CSF ، الوسائط إلى قارورة ثقافة.

يتسبب M-CSF في تمايز السلف النخاعي إلى البلاعم ، والتي تبدو متفرعة وتلتصق بالقارورة.

تخلص من الوسائط المحتوية على الخلايا غير الملتصقة. أضف وسائط M-CSF ، واحتضنها. بمجرد أن تصل البلاعم إلى حالتها الوظيفية الكاملة ، قم بحصدها. الطرد المركزي.

أعيد تعليق البلاعم الصفائحية في وسائط M-CSF في آبار صفائح متعددة الآبار. بعد التصاق البلاعم بالآبار ، أضف الغلوبولين المناعي البشري متعدد النسيلة وعديد السكاريد الدهني البكتيري ، LPS ، وهو سام.

ترتبط الغلوبولين المناعي بمستقبلات FCγ محددة ، بينما يرتبط LPS بمستقبلات شبيهة ب Toll على البلاعم. يؤدي هذا التحفيز المشترك إلى تنشيط البلاعم المضادة للالتهابات عبر شلالات الإشارات النهائية ، مما يتسبب في إطلاق مستويات عالية من السيتوكينات المضادة للالتهابات ومستويات منخفضة من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات.

اجمع الوسائط المحتوية على السيتوكين لمزيد من التحليل لتأكيد تنشيط البلاعم.

قم بتأمين الفأر الرحيم على لوح رغوي مع ممد أطرافه ، ثم نظف الساقين بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، قم بعمل قطع ضحل بعمق حوالي 2 ملم لإزالة الجلد والفراء من سطح كل ساق خلفية. ثم قم بتشريح الأنسجة للوصول إلى الظنبوب وعظم الفخذ.

لإزالة الظنبوب وعظم الفخذ ، قم بقطع العظام والعضلات أسفل مفصل الورك وفوق الكاحلين. ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة العضلية من العظام. بعد ذلك ، نظف العظام بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تتبخر لمدة دقيقة واحدة ، ثم ضع العظام في طبق من 6 آبار مملوءة بوسط تدفق العظام.

في اللوحة ، قم بقص 1 ملم من طرفي عظم الفخذ بحيث تتعرض التجاويف الداخلية. تأكد من أن إبرة قياس 26 يمكنها الوصول إلى التجاويف. بعد ذلك ، افصل الساق وعظم الفخذ عن مفصل الركبة. ثم أدخل الإبرة المتصلة بحقنة سعة 10 مليلتر في تجويف العظام واجمع نخاع العظام.

قم بتجميع نخاع العظم من جميع العظام الأربعة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مع 5 ملليلتر من وسط تدفق العظام. ماصة الوسط والنخاع لأعلى ولأسفل عدة مرات ، أو دوامة بسرعة بطيئة لتفريق الكتل برفق في التعليق. يجب تقسيم خيوط النخاع إلى بقع صغيرة من النخاع يقل طولها عن نصف ملليمتر.

بعد ذلك ، قم بتعبئة الأنبوب إلى 50 مل بوسط تدفق العظام ونقله إلى قارورة زراعة الأنسجة مساحتها 75 سم مربع. احتضان نخاع العظم لمدة ساعة. أثناء الحضانة ، ستلتصق الخلايا الناضجة بالقارورة وستبقى الأسلاف المكونة للدم المرغوبة معلقة. انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر ، وقم بتدوير الخلايا إلى حبيبات.

بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 ملليلتر من وسط زراعة MCSF. بعد ذلك ، اضبط كثافة الخلية على 500,000 لكل مليلتر وقم بتحميل 30 مل في قارورة جديدة تبلغ مساحتها 75 سم مربع. استمر في زراعة الخلايا وفي الأيام 4 و 7 و 10 ، تحقق من أن الخلايا ملتصقة ومتفرعة قليلا باستخدام مجهر المجال الساطع بتباين الطور المقلوب.

عند فحص الخلايا ، تخلص من الوسيط الذي يحتوي على الخلايا غير الملتصقة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا الملتصقة باستخدام IMDM مرة واحدة ، وأضف 30 مل من وسط زراعة MSCF الطازج مرة أخرى إلى القارورة. في اليوم 10 ، استبدل الوسط ب 8 ملليلتر من المخزن المؤقت لتفكك الخلايا القائم على EDTA الخالي من الإنزيم لجمع الخلايا. احتضان الخلايا لفترة وجيزة ، ثم اكشط الخلايا برفق وتحقق من إطلاقها باستخدام المجهر.

بمجرد تحرير الخلايا ، انقل المخزن المؤقت مع الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 50 مليلتر ، ثم اشطف القارورة ثلاث مرات باستخدام 5 ملليلتر من IMDM لجمع المزيد من الخلايا. قم بتجميع جميع المجموعات ، وقم بطردها المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 3 ملليلتر من MCSF. الآن ، عد الخلايا واضبط تركيزها على 1 مليون لكل مليلتر.

بعد ذلك ، قم بلوحة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر في لوحة مسطحة القاع سعة 96 بئر. يجب أن تكون اللوحة بأكملها قابلة للتعبئة. استزراع الخلايا لمدة ساعة تقريبا حتى تلتصق. ثم تحفيزهم بتركيزات مختلفة من LPS أو الغلوبولين المناعي الوريدي أو كليهما ، المحضرة في IMDM. قم بإجراء جميع عمليات التلاعب بشكل مكرر أو ثلاثي النسخ وتأكد من الاحتفاظ بعناصر التحكم غير المعالجة ، ثم احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة وتحليل المواد الطافية.