تقييم المناعة التي يسببها اللقاح ضد العدوى البكتيرية في نموذج الفأر

لدراسة المناعة التي يسببها اللقاح ، خذ حقنة مليئة بلقاح السعال الديكي اللاخلوي. يحتوي اللقاح على بروتينات مستضدية للبكتيريا المسببة لأمراض الجهاز التنفسي - السعال الديكي Bordetella ، والمواد المساعدة التي تطيل التعرض للمستضد للحصول على استجابة مناعية مستدامة.

حقن اللقاح في العضل في فأر مخدر.

بعد الحقن ، تلتقط الخلايا العارضة للمستضد المقيمة ، APCs ، البروتينات المستضدية وتعالجها إلى ببتيدات ، وتقدمها على سطحها. ثم تهاجر هذه APCs إلى الغدد الليمفاوية القريبة وتتفاعل مع الخلايا التائية ، مما يؤدي إلى تنشيطها وتمايزها إلى خلايا تائية مستجيبة.

تنتشر هذه الخلايا التائية المستجيبة وتهاجر إلى أعضاء مختلفة ، بما في ذلك الرئتين ، حيث توجد كخلايا تائية للذاكرة المقيمة أو خلايا T_RM ، مما يؤدي إلى التحصين.

بعد التحصين، يتم إعطاء سلالة مقاومة للمضادات الحيوية من السعال الديكي الحي عن طريق الأنف. تدخل هذه البكتيريا أنسجة الرئة وتنشط خلايا T_RM. تفرز خلايا T_RM المنشطة السيتوكينات الالتهابية التي تجند الخلايا المناعية لإحداث إزالة بكتيرية.

احصد أنسجة رئة الفأر وتجانسها للحصول على معلق أحادي الخلية. انشر معلق الخلية المخفف على صفيحة أجار تحتوي على مضادات حيوية واحتضانها للسماح بتكوين مستعمرة بكتيرية.

يظهر النسيج المستخرج من الفأر المحصن عددا أقل من المستعمرات مقارنة بتلك الموجودة في الفأر غير المحصن ، مما يؤكد المناعة التي يسببها اللقاح ضد السعال الديكي.

للتحصين ، تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم في فأر مخدر يبلغ من العمر 6 إلى 12 أسبوعا وقم بتحميل حقنة أنسولين سعة 1 مليلتر مزودة بإبرة قياس 28.5 مع 0.1 مليلتر من اللقاح المعني. أمسك المحقنة بزاوية 45 درجة بحيث يكون الشطبة متجها لأعلى ، وأدخل الإبرة حوالي 5 ملليمترات في الدالية للفأر ، وحقن اللقاح.

احتفظ بإدخال الإبرة في العضلة لمدة 5 إلى 10 ثوان. بعد ذلك ، قم بتدوير المحقنة 180 درجة بحيث يكون الشطبة متجها لأسفل لإنشاء مانع للتسرب ، ولمنع تسرب اللقاح قبل سحب الإبرة ببطء من موقع الحقن. ثم أعد الماوس إلى قفصه مع المراقبة حتى الشفاء التام.

بعد حوالي أسبوعين من التعزيز، قم بإصابة الفئران المحصنة. أمسك الفأر المخدر من قفص الصدر الظهري خلف لوحي الكتف والرقبة ، وضع الماوس في وضع مستقيم للوصول إلى الأنف. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، ضع ببطء 20 إلى 25 ميكرولترا من اللقاح البكتيري محل الاهتمام على كل طبقة من ، مع إمساك الماوس حتى يتم استنشاق اللقاح بالكامل. بعد ذلك ، قم بتوصيل كمية متساوية من PBS المعقم لمجموعة واحدة من الفئران كعنصر تحكم سلبي.

عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، ضع الجانب البطني للفأر المصاب لأعلى على لوحة التشريح ، وقم بتأمين الأطراف. بلل الجسم بنسبة 70٪ من الإيثانول واستخدم الملقط لتثبيت الجلد أسفل البطن في وسط الحوض. باستخدام مقص حاد ، قم بعمل قطع رأسي حتى الفك السفلي ، وقم بتشريح الجلد من الجدار البريتوني. انقل الجلد إلى جانبي الذبيحة لإنشاء حقل خال من العوائق لحصاد الأعضاء المعقمة ، وامسك الصفاق السليم أسفل القفص الصدري عند الكبد أو بالقرب منه. اقطع الصفاق باتجاه القفص الصدري لكشف الجهاز الهضمي السفلي ، وحرك القولون إلى اليسار للكشف عن الطحال.

باستخدام ملقط منحني ، أمسك الطحال ، وقم بتشريح النسيج الضام بالمقص. بعد ذلك ، ضع الطحال في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على 3 ملليلتر من RPMI ، و 5٪ مصل بقري جنيني على الجليد. استخدم الملقط لتثبيت القفص الصدري في عملية الخنجري ، وقطع الحجاب الحاجز. يجب أن تنكمش الرئتان وتسقط باتجاه العمود الفقري.

اقطع القفص الصدري على الجانبين لإزالة درع الصدر ، وقطع الشرايين والأوردة الرئوية لعزل وإزالة الفص العلوي للرئة اليمنى. ثبت الفص في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر من الفورمالين المحايد بنسبة 10٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة على الأقل ، وعزل الفصوص المتبقية من الرئتين اليمنى واليسرى. بعد ذلك ، ضع الفصوص في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على 2 مل من الكازين بنسبة 1٪ في PBS على الجليد.

استخدم PIPETMAN سعة 1 مليلتر مع طرف لجمع الدم الذي يملأ تجويف الصدر ، ونقل الدم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر مسمى مسبقا على الجليد. قم بإزالة الغدد النكفية وتحت اللسان وتحت الفك العلوي والغدد الليمفاوية التي تغطي القصبة الهوائية ، وفتح وإزالة الأغشية الواقية المحيطة بالقصبة الهوائية. باستخدام ملقط ومقص ناعم ، افصل القصبة الهوائية بعناية عن المريء ، وأي نسيج ضام آخر من أعلى عظام الترقوة إلى أسفل الفك السفلي.

استخدم ملقطا لتثبيت القصبة الهوائية ، وقطع القصبة الهوائية في الجزء العلوي من الترقوة. اسحب القصبة الهوائية لأسفل لزيادة المرونة إلى أقصى حد ، وقم بقطع القصبة الهوائية في الجزء السفلي من الفك السفلي فوق الحنجرة مباشرة ، وعزل حوالي 1 سم من الأنسجة. بعد ذلك ، ضع العضو في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر مسمى مسبقا يحتوي على 0.3 مل من الكازين بنسبة 1٪ في PBS على الجليد.

الآن ، أدر الماوس للوصول الواضح إلى الأنف ، ورش الرأس بنسبة 70٪ من الإيثانول. يدويا ، أمسك خلف الجمجمة مباشرة ، واستخدم المقص لقطع اللحم الناعم للأنف ، بدءا من أسفل الأنف والتحرك لأعلى. قم بإزالة الفراء والجلد والشعيرات من حول الأنف ، وأدخل أطراف مقص منحني في الأحواض مع توجيه المنحنيات لأسفل.

اقطع الممر الأنفي باتجاه العينين ، مما يخلق تكوينا يشبه الخامس. بعد ذلك ، استخدم ملقطا دقيقا لجمع الحاجز الأنفي والأنسجة الرخوة داخل التكوين ، ووضع الأنسجة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر مسمى مسبقا يحتوي على 0.3 مل من الكازين بنسبة 1٪ في PBS على الجليد.

لمعالجة أنسجة الرئة ، انقل محتويات أنبوب عينة الرئة بالكامل إلى خالط معقم سعة 15 مليلتر ، واستخدم مدقة لتجانس الأنسجة. افصل العينة حتى لا تبقى جزيئات كبيرة من الأنسجة ، وأعد المعلق المتجانس إلى الأنبوب الأصلي سعة 15 مل. قم بإزالة كمية 0.3 ملليلتر لوحدات تشكيل مستعمرة الطلاء ، واجمع باقي التجانس عن طريق الطرد المركزي.

Aliquot 0.5 مل من المادة الطافية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المسماة مسبقا للتخزين عند سالب 20 درجة مئوية حتى تحليل تعبير السيتوكين بواسطة ELISA. بعد ذلك ، قم بتخفيف 0.1 ملليلتر من معلق الرئة المتجانس جانبا في 0.9 مل من PBS المعقم لكل تخفيف ، واستخدم موزعة مثلثة معقمة للوحة 0.1 مليلتر من كل تخفيف تم اختياره تجريبيا على ألواح Bordet-Gengou المصنفة مسبقا بنسبة 10٪ بالإضافة إلى الستربتومايسين.