JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 4:27 د • July 8th, 2025
تكوين العظم هو العملية التي تتمايز من خلالها سلائف ناقضات العظم وتندمج لتشكيل ناقضات العظم متعددة النوى.
لدراسة تأثير الجسم المضاد ل c-fms على تكوين العظم في المختبر ، خذ صفيحة مزرعة تحتوي على تعليق خلية نخاع عظم الفأر. أضف عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، M-CSF.
في الثقافة ، يرتبط M-CSF بمستقبله المحدد ، c-fms ، على خلايا السلائف النخاعية ، مما ينشط مسارات الإشارات ويسبب التمايز إلى ضامة نخاع العظام ، BMMs ، التي تمثل سلائف ناقضات العظم وتلتصق باللوحة.
قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة. احصد BMMs وبذرها في آبار متعددة الآبار. مكمل مع M-CSF ومنشط مستقبلات العامل النووي kappa-Β ligand ، RANKL.
أضف تركيزات متزايدة من الأجسام المضادة ل c-fms إلى الآبار.
في بئر التحكم ، يرتبط M-CSF بمستقبلات c-fms وينشط مسارات الإشارات ، مما يحفز تعبير مستقبلات RANK ويعزز بقاء BMM وانتشاره. يرتبط RANKL بمستقبلات RANK ، مما يؤدي إلى سلسلة إشارات ويسبب تمايز BMM والاندماج في ناقضات العظم.
في الآبار ذات تركيزات الأجسام المضادة الأعلى ، ترتبط الأجسام المضادة وتمنع مستقبلات c-fms بشكل فعال وتعطل الإشارات المطلوبة لتمايز ناقضات العظم ، وبالتالي تثبيط تكوين ناقضات العظم.
قم بإجراء تلطيخ لتحديد وتحديد مجموعات ناقضات العظم وتحديد تركيز الأجسام المضادة الفعالة لتثبيط تكوين العظم في تكوين ناقضات العظم الناجم عن RANKL.
قم بزرع 10 ملايين خلية لكل 10 ملليلتر في طبق استزراع 10 سم ، وأضف M-CSF إلى الخلايا. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 أيام. قم بإزالة الوسط بعد ثلاثة أيام ، واغسل الخلايا مرتين ، بقوة ، باستخدام 10 ملليلتر من PBS لإزالة الخلايا غير الملتصقة.
أضف 5 مل من درجة حرارة الغرفة 0.02٪ تريبسين-EDTA في PBS ، واحتضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 5 دقائق. ماصة الخلايا جيدا لفصلها. راقب المزرعة تحت المجهر للتأكد من انفصال الخلايا وظهورها مستديرة وعائمة في الوسائط.
عندما يتم فصل الخلايا ، قم بتعطيل التفاعل بإضافة 5 ملليلتر من alpha-MEM. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، اغسلها ب 5 مل من alpha-MEM وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من alpha-MEM.
قم بزرع 1 مليون خلية لكل 10 ملليلتر في طبق استزراع 10 سم ، وأضف M-CSF. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 أيام. حصاد الخلايا المرفقة ، والتي تمثل BMMs كسلائف ناقضات العظم بعد 3 أيام. بذور BMMs في 50,000 خلية لكل 200 ميكرولتر من alpha-MEM في صفيحة 96 بئرا لكل بئر.
أضف إلى كل بئر المحفزات المرغوبة ، ثم أضف M-CSF للحصول على تركيز نهائي يبلغ 100 نانوغرام لكل مليلتر. أضف الجسم المضاد المضاد ل c-fms إلى كل بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 4 أيام ، مع تغيير الوسائط كل يومين لمدة 4 أيام ، ثم تابع التلوين والمقايسات كما هو موضح في المخطوطة.