JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 3:50 د • July 8th, 2025
كبريتات ديكستران الصوديوم إلى التهاب القولون — وهو مرض التهابي في الأمعاء — حيث يؤدي اضطراب الحاجز الظهاري المعوي إلى الالتهاب.
لتقييم تلف الأنسجة، خذ أنسجة القولون الثابتة المعزولة من نموذج الفئران لالتهاب القولون الناجم عن DSS. اغمر الأنسجة في وسط التضمين لسهولة التقسيم ، وقم بتجميدها بسرعة.
باستخدام ميكروتوم التبريد ، احصل على قسم رقيق من الأنسجة واجمعه على شريحة زجاجية.
اغمس الشريحة في محلول يحتوي على صبغة الهيماتوكسيلين المؤكسدة المرتبطة بالكاتيون المعدني - مما يضفي شحنة موجبة على الصبغة. يرتبط مركب الصبغة بالحمض النووي سالب الشحنة ، مما يؤدي إلى تلطيخ النواة الأرجوانية المحمرة.
اغمر الأنسجة في محلول حمضي كحول متمايز ، وإزالة الصبغة غير المرتبطة على وجه التحديد من السيتوبلازم والمصفوفة خارج الخلية. اشطف الأنسجة بعامل أزرق - وسط قلوي - لإضفاء اللون الأزرق على النوى ، مما يعزز التباين.
اغمر الشريحة في زيادة تركيزات الكحول لتجفيف الأنسجة مما يعزز اختراق البقعة المضادة.
اغمس الأنسجة في البقعة المضادة - محلول اليوزين الحمضي - لإضفاء اللون الوردي على البروتينات السيتوبلازمية الأساسية والمصفوفة خارج الخلية. اغسل الشريحة بالكحول لإزالة اليوزين الزائد. اغمس الأنسجة في الزيلين لجعل الأنسجة شفافة — لفحص مجهري أفضل.
تحت المجهر ، يظهر قسم القولون تلف الأنسجة المتفاقم ، مما يشير إلى التهاب القولون الناجم عن DSS.
بالنسبة لتلوين الهيماتوكسيلين والأيوزين لأنسجة القولون المعزولة ، في صباح اليوم التالي ، اغمر قطع الأنسجة في 30٪ سكروز في PBS طوال الليل في أنابيب فردية سعة 15 ملليلتر لحماية العينات بالتبريد. في اليوم التالي ، قم بتضمين الأنسجة في درجة حرارة القطع المثلى أو مركب OCT وتبريد الأنسجة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصلب OCT.
ضع كتل OCT في ناظم البرد واضبط قرص السماكة على 12 ميكرومتر ، ثم قم بتقطيع وتجميع الأقسام المجمدة بسمك 12 ميكرومتر على شرائح المجهر الزجاجي. عندما يتم تقطيع جميع الأنسجة ، قم بتسخين الشرائح عند 65 درجة مئوية على طبق ساخن لمدة 20 دقيقة ، واغسل الأجزاء الساخنة لفترة وجيزة في الماء المقطر قبل تلطيخها بمحلول تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق.
قم بإزالة محلول الهيماتوكسيلين الزائد في ماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق ، وقم بتمييز الأقسام بحمض الهيدروكلوريك بنسبة 0.5٪ في الإيثانول لمدة 30 ثانية ، متبوعا بشطف لمدة دقيقة واحدة تحت ماء الصنبور الجاري. بعد ذلك ، اغسل العينات لمدة 1 دقيقة في PBS ، متبوعا بغسل آخر لمدة 5 دقائق تحت ماء الصنبور الجاري.
في نهاية الغسيل ، اغمر الأنسجة في سلسلة من الإيثانول الصاعد لمدة 10 ثوان لكل غمر ، متبوعا بالتلوين المضاد في اليوزين لمدة دقيقتين. لتجفيف العينات ، اغمر الشرائح في 95٪ من الإيثانول و 2 تغيير من الإيثانول 100٪ لمدة 5 دقائق لكل غمر ، متبوعا بالمسح مع تغييرين لمدة 5 دقائق في الزيلين. بعد ذلك ، قم بتسجيل تلف الأنسجة في القولون القريب والأوسط والبعيد لكل مجموعة تجريبية.