JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 3:23 د • July 8th, 2025
لتحفيز الخلايا الليمفاوية عن طريق المستدمية النزلية — وهي بكتيريا مسببة للأمراض، خذ معلقا من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المعزولة، أو PBMCs، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية والخلايا العارضة للمستضد أو APCs.
أضف معلقا بكتيريا واحتضانه في درجة حرارة فسيولوجية.
ترتبط مستقبلات التعرف على الأنماط على APCs بمكونات معينة من الخلايا البكتيرية ، مما يؤدي إلى البلعمة. يندمج البلعمة - الذي يحتوي على بكتيريا داخلية - مع الجسيم الليزومي ، مما يتسبب في تحلل البكتيريا ومعالجتها في شظايا الببتيد.
ترتبط جزيئات التوافق النسيجي الرئيسية أو جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير بشظايا الببتيد وتقدمها على سطح الخلية كمستضدات. ترتبط الخلايا الليمفاوية التائية بالمستضد المقدم عبر مستقبل الخلايا التائية.
أضف الأجسام المضادة التحفيزية المشتركة التي ترتبط بمستقبلات سطحية محددة على الخلايا الليمفاوية التائية. يؤدي الارتباط التآزري إلى تحفيز الإشارات النهائية ، مما يؤدي إلى تنشيط إنتاج سيتوكين الخلايا الليمفاوية التائية.
أضف مركب حجب جولجي - يمنع نقل البروتين الحويصلي من الشبكة الإندوبلازمية إلى جولجي - لتثبيط إفراز السيتوكين من الخلايا الليمفاوية التائية ، مما يسهل تراكم السيتوكين داخل الخلايا.
أضف مثبتا للحفاظ على التشكل الخلوي والمنظفات لنفاذية غشاء الخلية. أضف مزيجا من الأجسام المضادة المسماة بالفلورسنت ، بما في ذلك الأجسام المضادة المرتبطة بعلامات السطح الخاصة بالخلايا الليمفاوية التائية - التي تضع علامة على سطح الخلية - والأجسام المضادة الخاصة بالسيتوكين التي تخترق داخل الخلية لربط السيتوكينات داخل الخلايا.
قم بإجراء قياس التدفق الخلوي للكشف عن الخلايا ذات التألق المزدوج — مما يشير إلى إنتاج السيتوكين بواسطة الخلايا الليمفاوية التائية المحفزة.
قسم عينة الدم المحيطية إلى حصص للتحكم وتحفيز المستضد. أضف الأجسام المضادة التحفيزية المشتركة إلى كلتا العينتين ، ثم أضف الملوية النزلية غير القابلة للكتابة إلى عينة المستضد ، واحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك ، أضف عامل حجب جولجي Brefeldin A إلى العينات ، واحتضنها لمدة خمس ساعات أخرى. بعد تحلل كريات الدم الحمراء كما هو موضح سابقا ، قم بإصلاح الكريات البيض باستخدام 500 ميكرولتر من 1٪ إلى 2٪ بارافورمالدهايد لمدة ساعة واحدة. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، ثم تخلل 1 مليون خلية ب 100 ميكرولتر من 0.1٪ سابونين لمدة 15 دقيقة.
بعد ذلك ، احتضان الخلايا بأجسام مضادة مناسبة تحمل علامة الفلورسنت. اغسل الخلايا ثم قم بتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تحديد نسبة الخلايا المستجيبة للمستضد عن طريق بوابات مجموعات الخلايا الليمفاوية ذات الصلة. قم بإجراء تلطيخ الخلفية على الخلايا غير المحفزة لتحليل جميع السيتوكينات.