تحديد إنتاج ROS بواسطة العدلات عند التفاعل مع الأغشية الحيوية النظيرة

يتم التعرف على البكتيريا الموسومة بالأوبسونين بواسطة مستقبلات عدلات محددة ، مما يؤدي إلى البلعمة مع أنواع الأكسجين التفاعلية ، أو ROS ، والإفراج ، والتدهور البكتيري.

لتحديد إنتاج ROS بواسطة العدلات في المختبر ، خذ صفيحة متعددة الآبار. يحتوي بئر الاختبار على غشاء حيوي للمكورات العنقودية الذهبية يتكون من بكتيريا مدمجة في فيلم مصفوفة خارج الخلية. بئر التحكم بدون الأغشية الحيوية.

احتضان الأغشية الحيوية بمصل بشري ، مما يسمح للأوبسونين في المصل بعمل الأغشية الحيوية.

استنشق المصل. يغسل بالعازلة ، ويزيل الأوبسونين غير المرتبط. أضف العدلات واللومينول - مركب كيميائي إلى الآبار. جهاز الطرد المركزي ، مما يجعل العدلات بالقرب من الأغشية الحيوية.

باستخدام قارئ اللوحة ، قم بقياس اللمعان بمرور الوقت.

في البئر المحتوي على الأغشية الحيوية ، ترتبط العدلات بالأوبسونين في الأغشية الحيوية ، مما يتسبب في تنشيط العدلات واستيعاب البكتيريا في البلعمة. يتم تنشيط مسارات إشارات محددة ، مما يتسبب في تجميع NADPH oxidase على البلعمة.

يحفز NADPH oxidase نقل الإلكترون من NADPH إلى الأكسجين الجزيئي ، مما يولد ROS الذي يحلل البكتيريا. علاوة على ذلك ، يطلق أوكسيديز NADPH على غشاء الخلية ROS خارج الخلية.

ردا على ذلك ، تنتج بكتيريا الأغشية الحيوية إنزيمات تحيد ROS وتطلق الليكوسيدين الذي يشكل مساما في أغشية العدلات ويسبب التحلل ، مما يعطل إنتاج ROS. يتفاعل Luminol مع ROS ، مما يسبب إثارته ، وينبعث منه لمعان عند الاسترخاء.

بئر الاختبار مستويات ROS متزايدة مقارنة بالتحكم ، مما يشير إلى تفاعلات الأغشية الحيوية ذات العدلات.

أضف 100 ميكرولتر من المصل البشري العادي بنسبة 20٪ المخفف في HBSS ، بالتنقيط ، إلى الأغشية الحيوية المغسولة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لمعالجة الأغشية الحيوية. استنشق محلول المصل ، واغسل الأغشية الحيوية ، بالتنقيط ، باستخدام 150 ميكرولتر من HBSS. استنشق HBSS ، تاركا وراءه آبار ذات أغشية حيوية opsonized.

أضف اللومينول إلى العدلات المعلقة في HBSS لتكوين تركيز نهائي يبلغ 5 ميكرومولار لومينول. هذا المحلول جاهز للاستخدام للمجموعتين A و C. أضف العدلات الممزوجة باللومينول إلى الآبار ذات الأغشية الحيوية المضادة.

بالنسبة للمجموعة D ، قم بإعداد 50 محلول ميكرومولار لومينول في HBSS في أنبوب منفصل بدون أي عدلات ، وإضافته إلى البئر الذي يحتوي على الأغشية الحيوية. Aliquot 350 ميكرولتر من العدلات الممزوجة باللومينول ، وإضافة PMA بتركيز نهائي قدره 500 نانوغرام لكل مليلتر إلى الخليط.

بالنسبة للمجموعة B ، أضف العدلات من هذا الخليط إلى الآبار بدون غشاء حيوي. هذا بمثابة تحكم إيجابي. قم بالطرد المركزي للوحة عند 270 RCF لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. تأكد من ضبط قارئ اللوحة على 37 درجة مئوية ، واللمعان والقراءة الحركية لمدة 60 دقيقة بفواصل زمنية مدتها 3 دقائق.

ضع اللوحة في قارئ اللوحة لقياس إنتاج ROS بواسطة العدلات لمدة 60 دقيقة.