اختبار في المختبر لدراسة التفاعل بين العدلات والأغشية الحيوية

الأغشية الحيوية هي مجموعة من البكتيريا الملتصقة بالسطح المضمنة داخل مصفوفة من المواد البوليمرية خارج الخلية ، EPS ، من أصل ميكروبي.

لدراسة تفاعلات الخلايا الحيوية للخلايا المناعية في المختبر، خذ شريحة تحتوي على غشاء حيوي من المكورات العنقودية الذهبية — وهو ممرض انتهازي. تعبر البكتيريا المهندسة عن بروتين فلوري للكشف المجهري. تتصل القناة بالخزانات المملوءة بالوسائط لتزويد البكتيريا بالعناصر الغذائية.

أضف تعليقا من العدلات المسمى بصبغة تتبع الخلايا الفلورية. يحتوي الوسيط أيضا على هوموديمر الإيثيديوم ، الذي يلطخ الحمض النووي للخلايا الميتة. احتضان في ظل الظروف الفسيولوجية.

ترتبط مستقبلات التعرف على الأنماط على العدلات بالأنماط الجزيئية المرتبطة بممرض الأمراض على البكتيريا. يحفز الارتباط العدلات على البلعمة للبكتيريا وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية خارج الخلية أو ROS ، مما يؤدي إلى قتل البكتيريا.

للتهرب من الاستجابة المناعية ، تطلق البكتيريا إنزيمات إزالة السموم التي تقلل من أنواع ROS وسم الليوكوسيدين الذي يسبب موت الخلايا. يرتبط الليوكوسيدين الأحادي بمستقبلات محددة على العدلات ويخضع لتعدد المسام لتشكيل مسام ، مما يعطل سلامة الغشاء ويقتل الخلايا.

يدخل homodimer الإيثيديوم من خلال غشاء الخلية التالف ، مما يؤدي إلى تلطيخ الخلايا الميتة.

تحت المجهر الفلوري واسع المجال ، تظهر مجموعة فرعية من الخلايا البكتيرية والعدلات ميتة ، مما يشير إلى تفاعل العدلات والأغشية الحيوية.

استخدم سلالة فلورية من المكورات العنقودية الذهبية ، مثل USA300 التي تعبر عن GFP ، لتسهيل التصوير المجهري. احتضان العدلات مع 100 ميكرومولار BCD لمدة 30 دقيقة في هزاز عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي. تأكد من احتضان العينات في الظلام والحد من التعرض للضوء.

لغسل BCD الزائد ، قم بعمل عدلات الطرد المركزي عند 270 RCF لمدة خمس دقائق ، وشفط المادة الطافية. إعادة تعليق العدلات في HBSS الطازجة. بعد ذلك ، أضف homodimer ethidium -1 إلى العدلات الملطخة ب BCD بتركيز نهائي قدره 4 ميكرومولار لمراقبة العدلات والموت البكتيري.

اغسل الأغشية الحيوية باستخدام HBSS ، وأضف 150 ميكرولترا من العدلات إلى الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية الذهبية التي نمت في شرائح دقيقة. احتضان الشرائح الدقيقة في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة. سيعتمد عدد الخلايا البكتيرية على عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من طلاء الأغشية الحيوية لمدة 18 ساعة.

قم بتصوير تفاعل الأغشية الحيوية للعدلات باستخدام قنوات الفلورسنت المقابلة للأصباغ الفلورية أو الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث للبروتينات.