موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 3:23 دقيقة • July 8th, 2025
في الفئران ، تتكون الطبقة المخاطية للقولون من خلايا مناعية تحتوي على الصفيحة المخصوصة ، وتحيط بها ظهارة معبأة بإحكام تحمي الغشاء المخاطي. تؤدي المعالجة الكيميائية بكبريتات الصوديوم ديكستران إلى تعطيل الوصلات الضيقة ، مما يتسبب في تلف الخلايا الظهارية وتمكين الميكروبات اللمعية من اختراق الصفيحة الخاصة.
يؤديالتعرف الميكروبي في القولون على إفراز الكيموكينات ، مما يؤدي إلى تسلل الخلايا المناعية وإطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات. تؤدي هذه الاستجابة المناعية المبالغ فيها إلى التهاب القولون أو التهاب القولون.
لتقييم التهاب القولون الناجم عن المواد الكيميائية ، ابدأ بشريحة زجاجية تحمل قسما ثابتا من أنسجة القولون في الفأر معالجا مسبقا يظهر التهاب القولون الناجم عن المواد الكيميائية. عالج القسم بمزيج من الأجسام المضادة الأولية الخاصة بمستقبلات الخلايا المناعية التي ترتبط بالخلايا المناعية الخاصة بها.
يغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة. احتضان قسم الأنسجة بالأجسام المضادة الثانوية البيوتينيل ، والتي ترتبط على وجه التحديد بالأجسام المضادة الأولية. احتضان مع اقتران إنزيم الستربتافيدين ، الذي يتفاعل مع البيوتينات ، ويشكل مجمعات.
تراكب قسم الأنسجة بركيزة كروموجينيك؛ يضفي التفاعل بين الإنزيم والركيزة لونا بنيا على الخلايا المناعية. قم بصبغة القسم بصبغة الهيماتوكسيلين لتلطيخ نوى الخلية.
راقب الشريحة الملطخة تحت المجهر. تشير وفرة الخلايا المناعية البنية في المنطقة المتضررة إلى التهاب القولون الناجم عن المواد الكيميائية.
للتحليل الكيميائي المناعي ، بعد تسخين الأقسام لمدة 20 دقيقة على اللوحة الساخنة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة 10 دقائق لكل غسلة ، وتخلص من البيروكسيديز الداخلي مع حضانة بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ لمدة 10 دقائق.
في نهاية الحضانة ، اغسل العينات ثلاث مرات في PBS كما هو موضح ، وقم بمنع أي ارتباط غير محدد بمخزن مؤقت مانع ، لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استبدل المخزن المؤقت المانع بكوكتيل الجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية للحضانة الليلية عند 4 درجات مئوية.
في صباح اليوم التالي ، قم بشفط محلول الأجسام المضادة الأولية الزائدة ، واغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS. بعد الغسيل الأخير ، احتضان الشرائح بكوكتيل الأجسام المضادة الثانوية المناسبة للبيوتينيل متبوعا بوضع العلامات بمركب بيروكسيداز الستربتافيدين الفجل في درجة حرارة الغرفة.
لتصور الخلايا المناعية ، قم بتسمية العينات ب DAB حتى يتطور لون بني فاتح أو غامق وقم بتلطيخ الأقسام بالهيماتوكسيلين والأمونيا المخففة بنسبة 0.3٪.
عندما تجف الشرائح ، استخدم مجهرا ضوئيا للحصول على صور ساحلية ساطعة لأقسام الأنسجة تحت تكبير 10 مرات ، واستخدم برنامج معالجة الصور لتحديد وتحديد عدد الخلايا المناعية المحددة في كل من الظهارة والصفيحة الخاصة.