قتل خلايا K562 بواسطة خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المعرضة لمستحضرات منتجات التبغ

تنشط الخلايا السرطانية الخلايا المناعية المستجيبة لإطلاق السيتوكينات والحبيبات المحللة للخلايا التي تحتوي على البرفورين والجرانزيم. يشكل البرفورين مساما في غشاء الخلية السرطانية ، مما يسهل دخول الجرانزيم إلى الخلية ويبدأ موت الخلايا المبرمج ، مما يتسبب في موت الخلايا.

لتحليل الوظيفة المحللة للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي البشري ، PBMCs ، بعد إعداد منتج التبغ ، TPP ، التعرض ، خذ صفيحة متعددة الآبار مع زيادة تركيزات TPP. يعمل البئر المحتوي على الوسط كعنصر تحكم.

أضف تعليق PBMC. عامل المثبط للمناعة الأساسي TPPs ، النيكوتين ، يرتبط بمستقبلات أستيل كولين النيكوتين المستجيب PBMCs ، مما يقلل من تنظيم إنتاج السيتوكين المؤيد للالتهابات.

الطرد المركزي. إزالة طافي المحتوية على برنامج النقاط التجارية. إعادة تعليق PBMCs في الوسائط. أضف خلايا K562 المصنفة بالفلورسنت ، وخلايا سرطان الدم البشرية التي لديها قابلية متزايدة للسمية الخلوية للخلايا المستجيب PBMC ، إلى الآبار.

تظهر الخلايا المستجيبة المعالجة ب TPP ذات الاستجابات المناعية المكبوتة تعبيرا منخفضا عن بيرفورين وإفراز السيتوكين ، مما يقلل من قدرة PBMC على التحلل الخلوي.

الطرد المركزي. أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت متبوعا بصبغة فلورية غير منفذة للخلية. تدخل الصبغة إلى الخلايا ذات الأغشية المعرضة للخطر وتلطخ الحمض النووي.

باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، حدد نسبة خلايا K562 الميتة والحية في الآبار. تشير نسبة أقل من خلايا K562 الميتة في الآبار ذات تركيزات TPP الأعلى من التحكم إلى قمع قتل خلايا K562 بواسطة PBMCs المعالجة ب TPP.

بعد تحضير طبق من PBMCs المعالجة بمنتجات التبغ ، كما هو موضح للتو ، اغسل مزرعة خلايا K562 التي تم حصادها عند التقاء 80٪ في 10 ملليلتر من DPBS. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من DPBS, وعد الخلايا. ثم أضف 1 مليلتر من محلول عمل CFSE المحضر حديثا إلى 1 إلى 2 مرات 10 إلى خلايا K562 السابعة في 1 مليلتر من الوسط الكامل ، وتفريق بقعة الخلية عن طريق الدوامة.

احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة. بعد دقيقتين بالضبط ، أضف 200 ميكرولتر من FBS ، وقم بتدوير الخلايا مرة أخرى ، واحتضانها لمدة دقيقتين أخريين.

بعد الحضانة الثانية ، اغسل الخلايا في 10 مل من الوسط الكامل. ثم أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر آخر من الوسط الكامل وعد الخلايا. الآن ، قم بالطرد المركزي PBMCs المعالجة بالتبغ ، وصب المادة الطافية. بعد ذلك ، استبدل الغطاء ، وأعد تعليق الخلايا عن طريق الدوامة ، واغسلها في 200 ميكرولتر من الوسط الكامل لكل بئر.

لبدء مقايسة القتل ، أضف خلايا K562 المسماة CFSE إلى PBMCs بنسبة 1 إلى 15 ، واحتضان الزراعة المشتركة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد خمس ساعات ، قم بتدوير الخلايا وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الكريات عن طريق الدوامة ، ثم اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر. بعد ذلك ، أضف 95 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتشغيل متبوعا ب 5 ميكرولتر من 7-AAD ، لحجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر.

أخيرا ، قم باحتضان الخلايا في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، ثم أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الجاري إلى كل بئر ، وانقل الحجم بالكامل إلى أنابيب FACS المناسبة لتحديد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل 7-AAD و CFSE عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي.