تقنية في المختبر لدراسة العلاجات المضادة للميكروبات على المجاميع البكتيرية

لدراسة تأثير مضادات الميكروبات على المجاميع البكتيرية، خذ مزرعة الزائفة الزنجارية في وسط نمو يعزز تكوين الركام — يحاكي النمو أثناء الإصابة.

تعبر البكتيريا المهندسة عن بروتين فلوري للكشف عن الركام تحت المجهر الفلوري. صورة بثلاثة أبعاد لحساب حجم الركام ، أو الكتلة الحيوية البكتيرية ، وتصور الزيادة في الكتلة الحيوية بمرور الوقت ، مما يشير إلى نمو البكتيريا.

أضف الكوليستين - وهو ببتيد كاتيوني مضاد للميكروبات - بتركيز شبه مميت يقتل البكتيريا الحساسة أثناء اختيار البكتيريا التي تتحمل المضادات الحيوية.

يرتبط الكوليستين بعديدات السكاريد الدهنية سالبة الشحنة ، أو LPS ، على الغشاء الخارجي البكتيري ، مما يؤدي إلى إزاحة الجسور الموجبة التي تعمل على تثبيت طبقة LPS أحادية الطبقة - مما يضر بسلامة الغشاء.

يدخل الكوليستين إلى المحيط ويرتبط ب LPS على غشاء الخلية ، مما يعطل الغشاء ويؤدي إلى تحلل الخلايا. كآلية مضادة ، تعمل الطفرات الجينية المحددة في مجموعة فرعية من البكتيريا على تحييد الشحنة السالبة ل LPS. يمنع هذا التعديل التفاعل الكهروستاتيكي للكوليستين الكاتيوني مع LPS أقل أنيونية - مما يمنع موت الخلايا.

صورة لتصور انخفاض الكتلة الحيوية مع مرور الوقت ، مما يشير إلى تأثير مضادات الميكروبات. أضف يوديد البروبيديوم أو PI - صبغة فلورية - تدخل من خلال الغشاء التالف لربط الحمض النووي ، مع تسمية الخلايا الميتة فقط.

قم بإجراء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، أو FACS ، وفصل الخلايا الحساسة المسمى PI والخلايا التي تتحمل المضادات الحيوية المصنفة بالفلورسنت. الخلايا جاهزة لإجراء فحوصات المصب.

لتصوير مجاميع Pseudomonas aeruginosa بواسطة مجهر المسح بالليزر متحد البؤر ، في نهاية الحضانة ، قم بتعيين ثلاثة آبار من لوحة الاستزراع حيث يتكرر العلاج بالمضادات الحيوية في بئر واحد مثل "عدم التحكم في المعالجة" ، ووضع اللوحة على المرحلة الساخنة من المجهر.

حدد هدف غمر الزيت 63 مرة، وافتح علامة التبويب تحديد الموقع لتحديد المجاميع البكتيرية في المجال الساطع. حدد منطقة للتصوير داخل كل بئر ، واستخدم وحدة المواضع لتخزين موضع المنطقة. اضبط الطول الموجي للإثارة على 488 نانومتر والطول الموجي للانبعاث على 509 نانومتر.

في الوحدة النمطية Acquisition، حدد خيار Z-Stack للحصول على الصور، واستخدم الوحدة النمطية Line Mediaaging لتقليل مضان الخلفية في قناة GFP ضمن الحجم الإجمالي لصور Z-stack. اضبط خيار السلسلة الزمنية لالتقاط 60 شريحة في كل بئر بفواصل زمنية مدتها 15 دقيقة لمدة 18 ساعة ، واستخدم استراتيجية التركيز المحددة لتخزين مستوى بؤري لكل موضع سيتم إعادة تصويره في كل نقطة زمنية طوال التجربة.

بعد 4.5 ساعة من إعداد تجربة التصوير ، قم بتصوير كل موضع لتحديد الكتلة الحيوية الكلية داخل كل من الآبار الأربعة قبل إضافة المضاد الحيوي. بعد ست ساعات ، أضف المضاد الحيوي برفق مرتين أقل من الحد الأدنى للتركيز المثبط إلى منتصف كل بئر ، أسفل واجهة الهواء السائل مباشرة ، وانقر فوق بدء التجربة لبدء تصوير العلاج بعد المضادات الحيوية.

لعزل الخلايا الحية ، في نهاية فترة التصوير التي تبلغ 18 ساعة ، قم بتسمية البكتيريا في كل بئر بالحجم المناسب من يوديد البروبيديوم ، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. في نهاية الحضانة ، استخدم حاوية معزولة لنقل اللوحة إلى مقياس التدفق الخلوي ، واضبط مقياس الخلوي للكشف عن GFP ويوديد البروبيديوم باستخدام فوهة 70 ميكرون. بعد ذلك ، قم بتشغيل حصص 1 مليلتر من كل مادة طافية للثقافة بأقل معدل تدفق لفرز مجاميع البروبيديوم الإيجابية لليوديد غير القابلة للحياة والسلبية لليوديد Pseudomonas aeruginosa.