القياس الكمي للعدوى البكتيرية في الخلايا المضيفة عن طريق فحص وحدة تكوين المستعمرة

لبدء وحدة تشكيل المستعمرة ، أو CFU ، الفحص لتحديد البكتيريا القابلة للحياة ، خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على البلاعم المستزرعة في وسط النمو. تصيب البلاعم بالليستيريا المستعدة ، وهي بكتيريا مسببة للأمراض قادرة على النمو داخل الخلايا.

أثناء الإصابة ، تبتلع البلاعم البكتيريا ، وتستوعب البكتيريا داخل حجرة مرتبطة بالغشاء - البلعمة.

تفرز البكتيريا سما مكنا للمسام وتعطل الغشاء البلعمي. وبالتالي ، يسمح للبكتيريا بدخول العصارة الخلوية والتكاثر داخل الضامة.

عالج الضامة المصابة لفترة وجيزة باستخدام الجنتاميسين ، وهو مضاد حيوي يقضي بشكل انتقائي على البكتيريا غير الداخلية مع الحفاظ على البكتيريا داخل الخلايا.

استنشاق الوسائط العلوية التي تحتوي على مضادات حيوية. بعد ذلك ، أضف الماء المقطر المعقم فوق البلاعم المصابة ، مما يخلق بيئة منخفضة التوتر. هذا يؤدي إلى التناضح ، حيث تدخل جزيئات الماء إلى الخلايا وتسبب تحلل البلاعم ، وتطلق المكونات داخل الخلايا ، بما في ذلك البكتيريا.

انشر محللة الخلية التي تحتوي على بكتيريا داخل الخلايا على صفيحة أجار lysogeny ، مما يعزز فصل الخلايا البكتيرية الفردية ويتيح نموها المستقل. أثناء الحضانة ، تنمو البكتيريا القابلة للحياة على سطح الأجار وتشكل مستعمرات متميزة.

عد المستعمرات على اللوحة واحصل على CFU ، الذي يمثل البكتيريا داخل الخلايا التي تهربت من الاستجابة المناعية للمضيف وتتكاثرت بنجاح داخل الضامة المصابة.

للحصاد ، قم بإمالة الطبق قليلا واستخدم ماصة بعناية لإزالة الوسائط بأكملها من البئر. أضف 0.5 مل من الماء المقطر المعقم إلى البئر. بعد 30 ثانية ، انقل محللة الماء الناتجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ودوامة بقوة لمدة 10 ثوان.

أضف 4.5 ميكرولتر و 50 ميكرولترا من محللات الماء إلى 450 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم لتحضير التخفيفات 10 أضعاف و 100 ضعف. باختصار ، دوامة لضمان الخلط الشامل. أضف 50 ميكرولترا من العينات الأصلية المخففة 10 أضعاف و 100 أضعاف المخففة على ألواح أجار مرق lysogeny ووزعها باستخدام موزع اللوحة.

لفحص Lm الناشئ ، استخرج 10 ميكرولتر من وسائط التراكب من الطبق ، وقسمها إلى قسمين من 5 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. أضف 5 ميكرولتر من DMEM / FCS إلى حصة واحدة وأضف 5 ميكرولتر من DMEM / FCS تحتوي على 5 ميكرولتر لكل مليلتر جنتاميسين إلى الحصة الثانية كعنصر تحكم.

انتظر 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 90 ميكرولترا من الماء المقطر المعقم إلى كل حصة وقم بدوامة الأنبوب بقوة لمدة 10 ثوان. ثم أضف 50 ميكرولترا من العينة على ألواح أجار LB ، ووزعها باستخدام موزع اللوحة. قم بتخزين الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة يومين قبل تعداد مستعمرات Lm.