تحليل قياس التدفق الخلوي لجينات الليستريا المستوحدة داخل الخلايا والناشئة خارج الخلية في المختبر

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على ثقافة البلاعم. تصيب ببروتين الفلورسنت التي تعبر عن الليستريا مونوسيتوجينس، Lm.

ترتبط البروتينات الموجودة على Lm بمستقبلات ضامة محددة ، مما يستوعب البكتيريا داخل البلعمة. بالإضافة إلى ذلك ، يفرز Lm السموم المكونة للمسام التي تعطل غشاء البلعمة ، وتطلق البكتيريا في العصارة الخلوية ، حيث تتكاثر وتصبح محاطة بخيوط الأكتين المضيفة.

تحفز بروتينات ActA المحفزة لتجميع الأكتين على Lm بلمرة الأكتين المستمرة في الطرف الخلفي للبكتيريا. يدفع ذيل مذنب الأكتين المتولد Lm عبر العصارة الخلوية ويخترق غشاء خلية البلاعم ، ويطلق Lm المبلمر المغلف بالأكتين في الوسائط.

بعد الحضانة ، قم بجمع وإصلاح الوسائط خارج الخلية ، المرتبطة بالأكتين ، المحتوية على LM من مجموعة من الآبار. إصلاح Lm باستخدام بارافورمالدهايد. أضف الماء المقطر ، وتمزق البلاعم وإطلاق LM داخل الخلايا. اجمع Lm داخل الخلايا وقم بإصلاح العينة باستخدام بارافورمالدهايد.

في الآبار الأخرى ، استبدل الوسائط بوسائط تحتوي على جنتاميسين غير منفذة للخلية للتخلص من LM خارج الخلية. استبدلها بوسائط جديدة واحتضانها للفترة المطلوبة.

بعد الحضانة ، اجمع الوسائط المحتوية على Lm خارج الخلية وقم بإصلاح العينة باستخدام بارافورمالدهايد. استخدم الماء المقطر للحصول على الليزات التي تحتوي على Lm داخل الخلايا وإصلاح العينة باستخدام بارافورمالدهايد. أضف الفالودين المسمى بالفلورسنت إلى العينات ، والذي يرتبط بشكل انتقائي بالأكتين المبلمر.

باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، تصور إشارات الفلورسنت من Lm والفالودين المرتبط بالأكتين في العينات. تحديد كمية Lm المرتبط بالأكتين خارج الخلية وداخل الخلايا المشتق من البلاعم المصابة.

باستخدام عداد خلوي آلي ، اضبط خلايا RAW 264.7 المحضرة على تركيز 1 × 10⁶ خلايا لكل مليلتر. أضف 1 مليلتر من العينة إلى آبار لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار. تصيب الخلايا مع أعد لقاح Lm المقابلة لتعدد العدوى من 50.

بعد 1.5 ساعة من الإصابة ، في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملم مملوء ب 500 ميكرولتر من 4٪ PFA ، اجمع الوسائط من المجموعة الأولى من الآبار ، ووضع الأنبوب على الجليد. لجمع LM داخل الخلايا ، أضف 1 مليلتر من الماء المقطر المعقم إلى كل بئر. بعد 60 ثانية ، انقل محللة الماء الناتجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر مع 500 ميكرولتر من 4٪ PFA. دوامة الأنبوب بقوة لمدة 10 ثوان وضعه على الجليد.

بالنسبة للآبار المتبقية ، قم بإزالة الوسائط واستبدلها ب 1 مليلتر من DMEM / FCS مع 5 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين لقتل Lm خارج الخلية.

بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الوسائط واستبدلها ب DMEM / FCS بدون جنتاميسين. بعد ساعتين وأربع ساعات أخرى ، اجمع الوسائط في المحللات للمرة الثانية والثالثة في الأنابيب وضعها على الجليد لتبرد. أنابيب الطرد المركزي عند 10,000 مرة جم لمدة 7 دقائق.

باستخدام ماصة ، قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. أضف كوكتيل تلطيخ يحتوي على 50 ميكرولتر من 4٪ PFA و 15 ميكرولتر من الفالودين في الأنبوب ، واخلطه لإعادة تعليق كل حبيبات. احتضان الأنابيب في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد الحضانة ، أضف 1 مليلتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب والماصة لأعلى ولأسفل للخلط. أنابيب تدور في جهاز الطرد المركزي عند 10,000 مرة جم لمدة 7 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.

للاستخدام الفوري ، قم بتعليق كل حبيبات في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. في حالة التخزين لتحليله لاحقا ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، و 200 ميكرولتر من 4٪ PFA في الأنبوب واخلطه للتعليق.