الكشف عن تنشيط الالتهابات عن طريق المجهر الفلوري

للكشف عن المستقبلات الشبيهة بالNOD P3 ، أو NLRP3 ، تنشيط الالتهابات ، خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على ضامة نشطة تعبر عن بروتينات NLRP3.

عالج الخلايا بوسائط تحتوي على الأيونوفورات والجلايسين. تحفز الأيونوفورات تدفق أيونات البوتاسيوم ، وتنشط بروتينات NLRP3 وتقليلها. يقوم NLRP3 قليل القلة بتجنيد بروتينات المحول ، مما يسهل ارتباط pro-caspase-1 ، وتشكيل مركب NLRP3 inflammasome.

على الالتهابات ، يؤدي القرب إلى الانقسام الذاتي المؤيد للكاسباز -1 ، وإطلاق الكاسبيس النشط ، وبدء داء الحمى والتكثيف النووي. بالإضافة إلى ذلك ، يعمل الجلايسين على استقرار بنية الخلية ، مما يمنع تحلل الخلايا.

عالج البلاعم باستخدام مجسات مراسل الفلورسنت التي تحتوي على مجموعة ربط كاسباز -1 وفلوروفور مرتبط عبر تسلسل الأحماض الأمينية. يتعرف الكاسباز -1 المنشط على تسلسل الأحماض الأمينية للمسبار ويرتبط بمجموعة ربط الكاسباز ، مما يتيح تصوره.

قم بإصلاح الخلايا وتراكبها بصبغة الفلورسنت لتلطيخ النوى. صورة تحت المجهر الفلوري.

عد البلاعم ذات النوى المكثفة الزرقاء وبؤر الفلورسنت الخضراء من الكاسباز المنشط -1 ، مما يشير إلى تنشيط NLRP3 للالتهابات.

ابدأ باستبدال الوسيط من البلاعم المشتقة من نخاع العظام المزروعة على أغطية زجاجية ب 290 ميكرولتر من وسط DMEM-5 مكمل ب 5 ميكرومولار نيجيريسين و 5 ملليمولار جلايسين لكل بئر. أعد الصفيحة المكونة من 24 بئرا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، مع إضافة 10 ميكرولتر من 30X FAM-YVAD-FMK بعد أول 15 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ب 1 مليلتر من PBS البارد لكل بئر ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل غسلة ، وقم بإصلاح الخلايا ب 250 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد لكل بئر لمدة 30 دقيقة على الجليد ، محمية من الضوء ، ووضع العلامات على الخلايا بصبغة نووية فلورية مناسبة خلال الدقائق الخمس الماضية.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS البارد كما هو موضح للتو ، وقم بتحميل كل شريحة ب 7 ميكرولتر من وسط التثبيت المضاد للبهتان. ضع غطاء على كل شريحة ، واترك وسط التثبيت يتماسك طوال الليل قبل إغلاق الغطاء بطلاء الأظافر.

لتصوير الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر الفلوري ، ضع شريحة التحكم غير المعالجة على مرحلة المجهر ، وركز يدويا على الخلايا. باستخدام إعدادات جدول البحث المجهري ، اضبط الإزاحة حتى لا يلاحظ أي مسبار إيجابي في الخلايا غير المعالجة.

بعد ذلك ، باستخدام عينة معالجة بالنيجيريسين ، حدد موقع الحقل الذي يحتوي على خلايا إيجابية وسالبة على حد سواء لتلوين المسبار ، واضبط مستوى التصوير لقناة المسبار على المستوى الذي يحتوي على أعلى شدة من التلوين الإيجابي. بعد ذلك ، اضبط الكسب حتى تظهر البؤر في الخلايا ذات النوى المكثفة ، واحصل على صور لخمسة حقول مختارة عشوائيا لكل شريحة بتكبير إجمالي 100X.