اختبار إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات للكشف عن موت البلاعم بعد التعرض للنيجريسين

خذ لوحة فحص تحتوي على البلاعم المعدة بعديدات السكاريد الدهنية.

يزيد التحضير من التعبير عن سلائف السيتوكين غير النشطة المؤيدة للالتهابات وبروتينات NLRP3.

أضف النيجيريسين ، وهو أيونوفور البوتاسيوم ، مما يعزز تدفق الأيونات. يؤدي هذا إلى تعطيل مستويات البوتاسيوم داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى بروتينات NLRP3 ، لتشكيل مركب كبير.

يقوم

NLRP3 قليل القلة بتجنيد بروتينات المحول ، ASC ، مما يتسبب في بلمرتها. تقوم خيوط ASC بتجنيد pro-caspase-1 ، وتشكل NLRP3-inflammasome ، وهو مركب متعدد البروتينات.

يخضع Pro-caspase-1 للتنشيط التلقائي الناجم عن القرب ، مما يولد caspase-1. يشق Caspase-1 السيتوكين المؤيد للالتهابات وبروتين gasdermin-D ، مما يخلق مسامية غشاء البلازما.

ينتج عن هذا إفراز السيتوكين وموت الخلايا المبرمج الالتهابي ، والتهاب الحمى ، وإطلاق محتويات داخل الخلايا ، بما في ذلك نازعة هيدروجين اللاكتات ، أو LDH. اجمع المادة المطفية المحتوية على LDH.

أضف خليط الركيزة - اللاكتات ، واليودونيتروتيرازوليوم البنفسجي ، أو صبغة INT ، و NAD + ، والديافوراز. يؤكسد LDH اللاكتات إلى البيروفات مع تقليل NAD +. يحفز Diaphorase تقليل INT ، مكونا فورميزان أحمر اللون.

تتوافق شدة اللون مع إطلاق LDH ، حيث تشير المستويات المرتفعة إلى زيادة تلف الخلايا المرتبطة بداء الحمى والوفاة.

لإجراء اختبار إطلاق LDH ، أضف 50 ميكرولترا من وسط DMEM-5 مكملا ب 10 ميكرومولار نيجيريسين إلى كل بئر تجريبي ، و 50 ميكرولترا من DMEM-5 إلى آبار التحكم في التحلل العفوية و 100٪ لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 30 دقيقة ، أضف 10 ميكرولتر من محلول التحلل 10x إلى آبار التحكم في التحلل بنسبة 100٪ ، وأضف 10 ميكرولتر من المتوسط إلى الآبار الأخرى. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للوحة ، وانقل 50 ميكرولترا من المادة الطافية من كل بئر إلى صفيحة شفافة ذات قاع مسطح.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من الركيزة المذابة والمعدة حديثا إلى كل بئر لمدة 30 دقيقة في الظلام ، وتحقق من اللوحة بعد 15 دقيقة للتأكد من أن الإشارة لن تتجاوز حد الكشف عن قارئ اللوحة. في نهاية الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من محلول التوقف لكل بئر ، وقم بقياس OD₄₉₀ على قارئ لوحة مناسب للسماح بحساب النسبة المئوية لتحلل الخلية لكل بئر.