تحريض وتصور مصائد العدلات خارج الخلية في العدلات المسماة مسبقا

ابدأ بلوحة متعددة الآبار تحتوي على عدلات مصنفة بالفلورسنت وعالجها بمصل المريض الذي يحتوي على أجسام مضادة للسيتوبلازم

.

تتفاعل هذه الأجسام المضادة مع مستقبلات Fc للعدلات ، وتنشط مسار الإشارات ، وتنتج أنواع الأكسجين التفاعلية أو ROS ، وتنشط الببتيديل أرجينين ديميناز.

يتسبب ROS في تحلل العدلات ، وإطلاق إنزيمات - الإيلاستاز والمايلوبيروكسيداز في السيتوبلازم. تنتقل هذه الإنزيمات والببتيديل الأرجينين المنشط إلى النواة.

يشق الإيلاستاز هيستون-H1 ، ويعدل المايلوبيروكسيداز الهستونات ، مما يؤدي إلى إزالة تكثيف الكروماتين. يحفز ببتيديل أرجينين ديميناز المنشط هيستون سيترولين ، ويحول بقايا الأرجينين إلى سيترولين ويساهم في مزيد من إزالة التكثيف.

يختلط الكروماتين غير المكثف مع البروتينات داخل الخلايا ، بما في ذلك البروتينات المضادة للميكروبات والسيتوبلازم. في وقت لاحق ، يتفكك غشاء العدلات ، ويطلق الكروماتين غير المكثف الممزوج بالبروتينات السيتوبلازمية في الفضاء خارج الخلية ، مكونا مصيدة عدلات خارج الخلية ، NET.

أضف صبغة DNA غير منفذة للخلية ، ترتبط حصريا بالحمض النووي خارج الخلية في NETs. تحت المجهر الفلوري ، تظهر العدلات باللون الأحمر مع هياكل خضراء تشبه الشبكة خارج الخلية ، مما يؤكد تكوين NET.

اصنع معلقا للخلية بكثافة 420,000 خلية لكل مليلتر في وسط RPMI-1640 الخالي من الفينول الأحمر الذي يحتوي على 2٪ FCS. أضف 37,500 عدلات في 90 ميكرولترا إلى كل بئر من صفيحة سوداء ذات قاع مسطح 96 بئرا.

بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من الحافز المختار ، ثلاث نسخ ، للوصول إلى تركيز 10٪ في كل بئر. قم دائما بتضمين عنصر تحكم سلبي في ثلاث نسخ. احتضن في الظلام عند 37 درجة مئوية للوقت المطلوب ، والذي يتراوح من 30 دقيقة إلى 2 أو 4 أو 6 ساعات. بعد ذلك ، قم بإعداد حجم صبغة الحمض النووي غير المنفذة اللازمة لإضافة 25 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي غير المنفذة 5 ميكرومولار للوصول إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومولار في كل بئر.

قبل 15 دقيقة من نهاية وقت الحضانة ، أضف 25 ميكرولترا من صبغة الحمض النووي غير المنفذة 5 ميكرومولار إلى كل بئر. استمر في الحضانة لمدة 15 دقيقة الأخيرة عند 37 درجة مئوية في الظلام. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية فائقة وتخزينها إذا لزم الأمر. أضف 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد. احتفظ باللوحة في الظلام ، وانتقل على الفور إلى القسم التالي.

بعد تكوين الإعدادات، حدد Z Series. حدد 10 كعدد الخطوات. حدد 3 ميكرومتر كحجم الخطوة. قم بتحميل اللوحة في المجهر متحد البؤر المناعي.

انقر فوق علامة التبويب "تشغيل". املأ اسم اللوحة ووصفها واختر موقع التخزين. حدد الآبار التي يجب الحصول عليها. اختر وقت التعرض ل Texas Red و FitC ، ثم انقر فوق Acquire Plate وابدأ عملية الاستحواذ ، والتي ستستغرق حوالي 1 ساعة لكل لوحة.

بعد ذلك، حدد تحليل الماكرو. ثم حدد W1 واختر قيمة الحد. بعد ذلك ، حدد قيمة البكسل المطلوبة ، وأخيرا ، في نافذة ImageJ ثانية ، حدد W2 واختر قيمة العتبة بقيمة البكسل المطلوبة. اختر وجهة لملف جدول البيانات. قم بتشغيل التحليل، واحفظ ملف السجل بعد ذلك.