اختبار إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات للكشف عن عدوى المستخفيات الحديثة في البلاعم

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على الضامة.

أضف Cryptococcus neoformans إلى آبار الاختبار ، بينما تحتوي آبار التحكم على البلاعم فقط.

البلاعم البلعمة الفطريات داخل البلعمة.

يغسل بمخزن مؤقت لإزالة الفطريات غير البلعمة. أضف وسائط خالية من المضادات الحيوية. حضن.

يندمج البلعمة مع الليزوزوم ، مكونا البلعمة. تعدل الفطريات درجة الحموضة البلعمية وتمتلك آليات جوهرية للبقاء على قيد الحياة في ظروف البلعمة القاسية. تتخلل الفطريات الغشاء البلعمي المزومي وتتكاثر ، مصحوبة بتراكم العصارة الخلوية للحويصلات المملوءة بالسكريات.

يتسبب البقاء الفطري داخل الخلايا والتكاثر في تلف الخلايا ، مما يؤدي إلى مسارات موت الخلايا. يؤدي هذا إلى تحلل البلاعم وإطلاق المحتوى داخل الخلايا ، بما في ذلك نازعة هيدروجين اللاكتات أو LDH ، في الوسائط.

اجمع الوسائط المحتوية على LDH في نقاط زمنية مختلفة. قم بتحليل البلاعم التحكم في نقاط زمنية مماثلة لتحقيق أقصى إصدار خلوي لإطلاق LDH. أضف خليط الفحص إلى الوسائط المجمعة والمحللات. يحول LDH اللاكتات إلى بيروفات ، مما يقلل NAD ⁺. يقلل الديافوراسي من ملح التيترازوليوم ، مكونا منتج فورمازان أحمر.

باستخدام قارئ اللوحة ، قم بقياس امتصاص الفورمازان لتحديد تحلل البلاعم بعد عدوى Cryptococcus neoformans.

لتحضير الخلايا الفطرية لعدوى البلاعم ، قم بجمع وأجهزة الطرد المركزي C. الخلايا النيوفورمانية من مزرعة مرحلة منتصف السجل ، متبوعة بثلاث غسلات لطيفة مع 1 مليلتر من PBS بدرجة حرارة الغرفة في نفس ظروف أجهزة الطرد المركزي.

بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الخلايا الفطرية عند 1.2 مرة 10 إلى الخلايا الثامنة لكل مليلتر ، بتركيز متوسط زراعة الخلايا الخالي من المضادات الحيوية ، وأضف 1 مليلتر من تعليق الخلايا الفطرية إلى كل من 4 آبار من 70٪ إلى 80٪ من لوحة ثقافة البلاعم المكونة من 6 آبار. ثم ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ثلاث ساعات. قم بإمالة اللوحة بحذر للسماح بغسل كل بئر برفق ثلاث مرات باستخدام 1 مليلتر من PBS لكل بئر لكل غسلة.

لقياس كفاءة العدوى بعد الغسيل الأخير ، أضف 1 مليلتر من الوسط الخالي من المضادات الحيوية إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 6 آبار ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. في النقاط الزمنية التجريبية المناسبة ، اجمع المادة الطافية من كل بئر ، وقم بقياس كمية LDH في كل بئر وفقا للبروتوكولات القياسية. في نفس النقاط الزمنية ، قم بتحليل خلايا البلاعم غير المصابة لتحديد قيمة أقصى قدر من السمية الخلوية.

يمكن بعد ذلك حساب السمية الخلوية باستخدام الصيغة كما هو موضح.