نظام عدوى قائم على إدراج غشاء قابل للاختراق لدراسة تأثير السموم البكتيرية

خذ نظام عدوى من غرفتين مفصول بغشاء قابل للاختراق. تحتوي الحجرة السفلية على خلايا كيراتينية بشرية ملتصقة ، أو خلايا جلدية.

أضف مسببات الأمراض البكتيرية في الغرفة العلوية ، واحتضنها. يمنع الغشاء الاتصال المباشر لمسببات الأمراض بالخلايا الكيراتينية. تفرز مسببات الأمراض الستربتوليسين S أو SLS - وهو سم صغير - يعبر الغشاء للوصول إلى الخلايا.

يتوسط الناقل المشترك لبيكربونات الصوديوم على الخلايا الكيراتينية في تدفق أيونات البيكربونات والصوديوم ، مما يحافظ على درجة الحموضة داخل الخلايا. يرتبط SLS بالناقل المشترك ويعطل نقل الأيونات ، مما يؤدي إلى إجهاد تناضحي داخل الخلايا.

تتسبب إشارات المصب الناجمة عن الإجهاد في تدهور المثبط المرتبط بالعامل النووي المعزول - Kappa B ، أو NF-κB ، مما يؤدي إلى تنشيطه. ينتقل NF-κB المنشط إلى النواة ، مما يؤدي إلى تنظيم إنتاج السيتوكين المؤيد للالتهابات.

عند الإفراز خارج الخلية ، ترتبط السيتوكينات بمستقبلات الموت على الخلية المضيفة ، مما يؤدي إلى حدوث نخر. بعد الحضانة ، حصاد المادة الطافية للثقافة لتقييم تأثير السم البكتيري.

قبل العلاج مباشرة ، استخدم 1X PBS لغسل الخلايا. بعد ذلك ، ضع 2 مل من وسط النمو الطازج مع أو بدون علاج دوائي على الألواح المكونة من ستة آبار ، أو 0.5 مل من الوسط على آبار ألواح 24 بئرا. بعد ذلك ، تحت غطاء التدفق الصفحي ، استخدم ملقطا معقما لوضع غشاء معقم قابل للاختراق بعناية 0.4 ميكرون في كل بئر.

يعد

التعامل اللطيف والمعقم مع الإدخالات القابلة للاختراق أثناء تحضير العدوى أمرا بالغ الأهمية لمنع الغشاء من التعرض للخطر أو التلوث أثناء هذه العملية.

ضع وسط زراعة الخلايا الطازجة على الغرفة العلوية لكل بئر ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بتطبيق حجم مناسب من الثقافات البكتيرية الطبيعية على الغرفة العلوية لنظام إدخال الغشاء المنفذ ، وقم بتطبيق الوسط البكتيري على آبار التحكم.

تعد

الإضافة الدقيقة للبكتيريا إلى الغرفة العلوية ، وكذلك النقل اللطيف للخلايا المصابة إلى الحاضنة ، أمرا بالغ الأهمية ، لأنه من الضروري ألا تلوث البكتيريا الغرفة السفلية أثناء الإعداد التجريبي.

لتقييم البروتينات المضيفة المفرزة ، استخدم ملقطا معقما لإزالة حشوة الغشاء النفاذة بعناية. بعد ذلك ، مع عدم إزعاج الطبقة الأحادية للخلايا ، اجمع الوسط من الغرفة السفلية إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر.

الطرد المركزي للعينات عند 14,000 RCF و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لبيليه الحطام الخلوي. بعد ذلك ، قم بإزالة كل المادة الطافية باستثناء 50 ميكرولترا ، وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل ، وخزنها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر ، أو استخدمها على الفور.