استخراج محللة الخلية المضيفة من الخلايا المضيفة المصابة المزروعة في نظام غشاء قابل للاختراق

ابدأ بزرع الخلايا المضيفة للثدييات في المقصورة السفلية لنظام الغشاء النفاذ.

أضف المكورات العقدية — وهي بكتيريا مسببة للأمراض معروفة بإفراز الستربتوليسين S أو توكسين SLS، إلى حشوة الغشاء. ينتشر سم SLS عبر مسام الغشاء ويصل إلى الخلية المضيفة.

تنظم الناقلات المشتركة للصوديوم وبيكربونات المرتبط بالغشاء نقل الأيونات ، مما يحافظ على التوازن الخلوي. يرتبط السم بهذه الناقلات المشتركة ، مما يعطل نقل الأيونات ويسبب الإجهاد التناضحي في الخلايا المضيفة.

يؤدي هذا إلى تنشيط العديد من شلالات الإشارات النهائية ، بما في ذلك p38 MAPK ، وهو مسار بروتين كيناز منشط بالميتوجين. يقوم p38 MAPK المنشط بفسفرة أهدافه النهائية ، مما يؤدي إلى استجابة خلوية ضد البكتيريا.

بعد ذلك ، قم بإزالة إدراج الغشاء النفاذ. استنشق الوسط فوق الخلايا المضيفة. أضف المخزن المؤقت للتحلل لتحرير المحتويات الخلوية. جهاز طرد مركزي لتكسير حطام الخلية.

اجمع المادة الطافية التي تحتوي على مكونات المحللة القابلة للذوبان والحبيبات التي تحتوي على مكونات محللة غير قابلة للذوبان. قم بتخزين العينات لمزيد من التحليل.

قبل العلاج مباشرة ، استخدم 1X PBS لغسل الخلايا. بعد ذلك ، ضع 2 مل من وسط النمو الطازج مع أو بدون علاج دوائي على الألواح المكونة من ستة آبار ، أو 0.5 مل من الوسط على آبار ألواح 24 بئرا. بعد ذلك ، تحت غطاء التدفق الصفحي ، استخدم ملقطا معقما لوضع غشاء معقم قابل للاختراق بعناية 0.4 ميكرون في كل بئر.

يعد

التعامل اللطيف والمعقم مع الإدخالات القابلة للاختراق أثناء التحضير للعدوى أمرا بالغ الأهمية لمنع الغشاء من التعرض للخطر أو التلوث أثناء هذه العملية.

ضع وسط زراعة الخلايا الطازجة على الغرفة العلوية لكل بئر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بتطبيق حجم مناسب من الثقافات البكتيرية الطبيعية على الغرفة العلوية لنظام إدخال الغشاء القابل للاختراق وقم بتطبيق الوسط البكتيري على آبار التحكم.

تعد

الإضافة الدقيقة للبكتيريا إلى الغرفة العلوية ، وكذلك النقل اللطيف للخلايا المصابة إلى الحاضنة ، أمرا بالغ الأهمية ، لأنه من الضروري ألا تلوث البكتيريا الغرفة السفلية أثناء الإعداد التجريبي.

استخدم ملقطا معقما لإزالة حشوة الغشاء النفاذة بعناية.

لتقييم محللات الخلية المضيفة ، قم بشفط الوسط برفق فوق الطبقة الأحادية دون إزعاج الخلايا المضيفة. ثم استخدم PBS لشطف الخلايا مرة واحدة. قم بشفط PBS برفق ، وقم على الفور بتطبيق حجم من المخزن المؤقت للتحلل المثلج لتحقيق ، على سبيل المثال ، تركيز بروتين يتراوح من 0.5 إلى 1.5 ملليغرام لكل ملليلتر. ثم احتضان العينات على الجليد لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، استخدم مكشطة خلية لفصل الخلايا عن سطح اللوحة لكل بئر ، ونقل محتويات كل بئر بالكامل إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 14,000 RCF و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

لتقييم مكونات المحللة القابلة للذوبان ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، وخزنها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر ، أو استخدمها على الفور. لتقييم مكونات المحللة النووية أو غيرها من المكونات غير القابلة للذوبان ، احتفظ بالحبيبات ، وخزنها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر ، أو استخدمها على الفور.